РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2015, том 55, № 1, с. 82-90
УДК 577.2.043:539.1:577.2.04:577.352:591.111.1
О НЕКОТОРЫХ АСПЕКТАХ ИЗМЕНЕНИЯ СТРУКТУРЫ МЕМБРАН ЭРИТРОЦИТОВ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ХЛОРИДА УРАНИЛА В НИЗКИХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ
© 2015 г. О. Г. Шевченко*
Институт биологии Коми НЦУральского Отделения РАН, Сыктывкар
В системе in vitro исследовано влияния иона уранила в наномолярных концентрациях на параметры, характеризующие структуру мембран эритроцитов грызунов разных видов (лабораторных мышей и полевок-экономок — классического объекта радиоэкологического мониторинга). Обнаружена повышенная чувствительность эритроцитов полевок-экономок к воздействию уранила, что может быть обусловлено особенностями структуры мембран эритроцитов этого вида — низким содержанием сфингомиелина. Исследование состава фосфолипидов эритроцитов, экспонированных с ионами уранила, свидетельствует об отсутствии в системе in vitro "типовых" реакций липидной компоненты мембран эритроцитов, характерных для циркулирующих в крови клеток, а также об изменениях, указывающих на возможность протекания начальных стадий процесса эриптоза. Появление скрытых изменений в структуре мембран эритроцитов животных обоих видов вследствие кратковременного контакта с ионами уранила подтверждается усилением их чувствительности к воздействию неионного детергента Тритон X-100 и указывает на изменение упорядоченности структуры липидной фазы мембраны.
Уран, эритроциты крови, фосфолипиды, тритон X-100, мыши, полевки-экономки. DOI: 10.7868/S0869803115010142
Уран является тяжелым металлом и одновременно а-излучателем. Токсическое действие урана, как и других актинидов, обусловлено его химическими и радиологическими свойствами [1, 2], в связи с чем этот металл представляет уникальные возможности для токсикологии [3]. В окружающей среде уран чаще всего встречается в наиболее стабильной форме уранил иона, представляющую высокую экологическую опасность в связи с хорошей растворимостью и биодоступностью [4, 5]. Благодаря высокой афинности к фосфатам, карбоксильным и гидроксильным группам, уранил способен взаимодействовать с липидами, белками и нуклеотидами с образованием стабильных комплексов [6—8]. Однако работ, в которых описываются клеточные и молекулярные механизмы токсичности урана, сравнительно немного, и большинство исследователей, работающих в этом направлении, считает, что необходимо более детальное исследование механизмов его биологического действия [3, 9—11].
Одним из удобных и широко распространенных объектов исследования в токсикологии, ра-
* Адресат для корреспонденции: Республика Коми, 167982 Сыктывкар, ул. Коммунистическая, 28, Институт биологии Коми НЦ УрО РАН; тел./факс: (8212) 43-04-78; e-mail: shevchenko@ib.komisc.ru.
диобиологии и фармакологии являются эритроциты млекопитающих. Эти безъядерные клетки претерпевают серьезные изменения не только при воздействии на организм комплекса неблагоприятных факторов [12—16], но и системе in vitro, благодаря чему находят применение при исследовании механизмов токсичности и биологической активности различных соединений, в том числе тяжелых металлов и радионуклидов [17—23]. В предыдущей работе [23] было показано, что даже кратковременный контакт эритроцитов лабораторных мышей с ионами уранила в наномолярных концентрациях приводит к изменению физико-химических свойств клеточной мембраны, что существенным образом модифицирует их реакцию на действие факторов, провоцирующих развитие острого окислительного стресса. Однако детальные механизмы воздействия низких концентраций ионов уранила на биомембраны требуют дальнейшего изучения. Важным аспектом исследований подобного рода является, на наш взгляд, тот факт, что эффект воздействия низкоинтенсивных факторов химической и физической природы в значительной мере определяется исходными характеристиками самого объекта [24—26], в нашем случае структурными особенностями мембраны эритроцита. Вместе с тем эритроциты млекопита-
ющих разных видов существенно различаются по биохимическим характеристикам мембран, в частности, по составу фосфолипидов [27], что подробно рассмотрено в работе [28]. Поскольку ранее сотрудниками отдела радиоэкологии Института биологии Коми Научного центра УрО РАН были проведены масштабные исследования биологических последствий загрязнения среды тяжелыми естественными радионуклидами, в которых основным объектом была полевка-экономка [15, 29— 31], представляло интерес провести часть модельных экспериментов с использованием эритроцитов этого вида животных.
Целью настоящей работы стало исследование влияния иона уранила в низких концентрациях на состав фосфолипидов мембраны эритроцитов животных разных видов и их чувствительность к воздействию дестабилизирующих мембрану химических соединений.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Объектом исследования служили эритроциты крови полевок-экономок (Microtus oeconomus Pall.) и лабораторных мышей (Mus musculus L.). Эритроциты отделяли от плазмы и других форменных элементов крови центрифугированием в течение 5 мин и трижды промывали физраствором (рН 7.4), эритроцитарную массу, полученную от нескольких животных, объединяли для каждой серии экспериментов. Инкубацию суспензии эритроцитов в физрастворе (рН = 7.4) проводили в термостатируемом шейкере Biosan ES-20 (Латвия) при 37°С и медленном перемешивании. В качестве источника ионов уранила использовали раствор UO2Cl2 (ч. д. а., Минхимпром СССР), в котором радиоактивный элемент представлен природной смесью изотопов (итоговая концентрация 5-1000 нмоль/л). Для дестабилизации мембраны использовали Тритон X-100, который вводили в суспензию эритроцитов в виде 1%-ного раствора в 0.9%-ный NaCl (итоговая концентрация 0.001 и 0.003%).
Для оценки динамики выживаемости клеток определяли степень гемолиза. Для этого каждый час из инкубационной среды отбирали аликвоту, центрифугировали в течение 5 мин (1600 g), степень гемолиза определяли по содержанию гемоглобина в супернатанте на спектрофотометре ThermoSpectromic Genesys 20 (США). Процент гемолиза рассчитывали по отношению к полному гемолизу образца по формуле:
А = Б/В х 100%,
где А — процент гемолиза, Б — оптическая плотность супернатанта исследуемого образца, В —
оптическая плотность супернатанта образца, подвергнутого полному гемолизу. Содержание вторичных продуктов перекисного окисления ли-пидов (ПОЛ), реагирующих с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК-активные продукты, ТБК-АП), анализировали спектрофотометрически, используя метод [32].
Для исследования влияния урана на биохимические параметры мембраны эритроцитов клетки инкубировали в присутствии ионов уранила в течение 4 ч в термостатируемом шейкере, при этом контрольные образцы не содержали раствор ура-нил хлорида. Затем суспензию эритроцитов подвергали центрифугированию, эритроциты отделяли, дважды промывали физраствором и проводили выделение липидов по методу Блая и Дайера в модификации Кейтса [33]. Разделение фосфолипидов (ФЛ) на отдельные фракции осуществляли методом тонкослойной хроматографии [34]. В качестве системы растворителей использовали смесь хлороформ-метанол-ледяная уксусная кислота-вода (50 : 30 : 8 : 4). Идентификацию ФЛ проводили с использованием стандартов (Sigma-Aldrich, USA). Количественный анализ отдельных фракций фосфолипидов осуществляли по образованию фосфорномолибденового комплекса в присутствии аскорбиновой кислоты [34]. Анализ состава ФЛ подробно описан в работе [35]. Статистическую обработку данных и построение диаграмм осуществляли с помощью пакета программ Microsoft Office Excel 2007 и Statistica 6.0. Экспериментальные данные на рисунках представлены в виде среднеарифметических значений с указанием их среднеквадратичных ошибок (M ± m). Статистическую значимость различий оценивали по непараметрическому критерию Манна—Уитни.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Эксперименты показали (рис.1, а, б), что эритроциты полевок-экономок отличаются большей чувствительностью к воздействию соединений урана по сравнению с эритроцитами лабораторных мышей. Если в первые часы инкубации присутствие ионов уранила в наномолярных концентрациях привело к снижению уровня спонтанной гибели эритроцитов животных обоих видов, то с увеличением времени экспозиции (24 ч) в отношении эритроцитов полевок проявлялась цито-токсичность уранила. Поскольку для эритроцитов полевок-экономок отмечена (рис. 2) статистически значимая связь (Rs = 0.976, р = 0.00003) между уровнем гемолиза и содержанием вторичных продуктов ПОЛ в суспензии, можно полагать, что активация ПОЛ в эритроцитах является
14 12
S 8
4
° 6
5 6 о
^ 4
2
0
0 5 10 50 100 250 500 750 1000 Концентрация, нмоль/л
□ 1 □ 2
100
90
80
% 70
з, 60
и 50
л о
м е 40
Г 30
20
10
0
Й
** Д
0 5 10 50 100 250 500 750 1000 Концентрация, нмоль/л
□ 1 □ 2
Рис. 1. Гемолиз эритроцитов крови в лабораторных мышей и полевок-экономок в присутствии и02С12 (0— 1000 нмоль/л) через 4 (а) и 24 ч (б) инкубации: 1 — эритроциты лабораторных мышей, 2 — эритроциты полевок-экономок.
а
*
*
одним из механизмов, обусловливающих высокую биологическую активность ионов уранила в данной модельной системе.
Результаты исследования состава фосфолипи-дов эритроцитов после инкубации в присутствии ионов уранила (1 мкмоль/л) в системе in vitro свидетельствуют, что в большинстве вариантов эксперимента имеет место уменьшение суммарного содержания фосфатидилсерина и фосфатидили-нозита (ФС и ФИ) в липидах эритроцитов, а в ряде случаев — статистически значимое снижение доли суммарных ФЛ в составе общих липидов (рис. 3, а). В липидах эритроцитов мышей после инкубации в среде, содержащей ионы уранила,
ТБК-АП, нмоль/мл 1.4
1.3 1.2 1.1 1.0 0.9 0.8
0.7
40
50
60
70
80
90 100 Гемолиз, %
Рис. 2. Соотношение между степенью гемолиза и содержанием вторичных продуктов ПОЛ в эритроцитах крови полевок-экономок в присутствии и02С12 (5— 1000 нмоль/л) через 24 ч инкубации.
отмечено также незначительное увеличение относительного содержания ФХ (на 5—13% по сравнению с контролем). Однако ни в одном из вариантов экспериментов не выявлено (рис. 3, б) статистически значимого увеличе
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.