РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2008, том 48, № 5, с. 600-605
^ ОБЩАЯ
РАДИОБИОЛОГИЯ
УДК 579:591.169.2:539.1.04
О ПРИРОДЕ ЯВЛЕНИЯ РЕАКТИВАЦИИ ВЫЖИВАЕМОСТИ БАКТЕРИЙ Eeheriehia coli НА ПОЗДНИХ ЭТАПАХ ИНКУБАЦИИ В СОЛЕВОМ БУФЕРЕ ПОСЛЕ ВОЗДЕЙСТВИЯ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ
© 2008 г. И. И. Морозов*, В. Г. Петин
ГУ Медицинский радиологический научный центр РАМН, Обнинск
Представлены экспериментальные данные, свидетельствующие о том, что феномен реактивации выживаемости в фосфатном буфере бактерий E. coli B/r имеет место только после облучения в определенном диапазоне доз у-радиации 60Со, индуцирующих гибель определенной доли популяции клеток, и не зависит от концентрации жизнеспособных микроорганизмов и наличия в суспензионной среде питательного материала, выходящего из облученных бактерий во внешнюю среду. Из данных следует, что в основе феномена лежат процессы, отличающиеся от процессов обычного клеточного размножения. Они могут быть следствием радиостимулирующего влияния на клеточную физиологию, известного из литературы как гормезис.
j-Излучение 60Со, бактерии, гибель, реактивация выживаемости, гормезис.
Как ранее установлено, выживаемость бактерий E. coli B/r и E. coli BS_ j, подвергнутых воздействию ионизирующей радиации, возрастает в условиях длительной (до 5 сут) инкубации их в солевом фосфатном буфере [1]. Аналогичные данные, касающиеся реакции интактных и облученных (у-излучение 60Со) дрожжевых клеток Sac-charomyces cerevisiae на инкубацию их в воде, представлены и в работах [2, 3]. Для объяснения полученных данных высказано предположение о радиационной стимуляции деления клеток выжившей доли клеточной популяции, т.е. о горме-зисе [2, 3]. Вместе с тем нельзя исключить, что феномен реактивации выживаемости облученных клеток даже в фосфатном буфере (среде малопитательной) при концентрации клеток, на два порядка превышающей "М"-концентрацию (предельно допустимую концентрацию, до которой возможно клеточное размножение), может быть обусловлен обычным размножением клеток вследствие освобождения биологической ниши в результате радиационной гибели клеток и повышения питательности среды из-за выхода из этих клеток во внешнюю среду энергетического и пластического материала [4].
С целью определения природы вышеуказанного феномена и верификации высказанного допущения исследовали влияние концентрации жизнеспособных клеток и материала, покидающего облученные микробные клетки, на интенсивность
* Адресат для корреспонденции: 249036 Обнинск, Калужская обл., ул. Королева, 4, ГУ МРНЦ РАМН; тел.: (48439) 7-47-43; факс (495) 956-14-40; e-mail: mrrc@obninsk.ru.
размножения интактных клеток и интенсивность реактивации жизнеспособности микроорганизмов, подвергнутых воздействию у-излучения 60Со, в условиях инкубации в фосфатном буфере. С этой же целью изучали влияние проникающей радиации в разных (в том числе и высоколетальных) дозах на величину феномена реактивации выживаемости облученных бактерий, инкубированных в подобном же буфере.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Исследования проводили на диком радиорезистентном штамме E. coli B/r. Клетки бактерий инкубировали в течение 18 ч при 37°С в питательном бульоне, содержащем пептона 1%, дрожжевого экстракта 1% и NaCl 1%. Инкубированные бактерии отмывали в 0.01 моль/л фосфатном буфере pH 7.0, содержащем NaCl в концентрации 1%, путем двукратного центрифугирования в течение 20 мин при 5000 об./мин на центрифуге "ОПн-8УХЛ 4.2" клеточных суспензий и ресус-пендирования клеток в подобном же буфере до концентрации 108 клеток/мл для последующего облучения и инкубирования.
Клеточные суспензии подвергали воздействию у-излучения 60Со на установке "Исследователь". Мощность дозы составляла 70.8 Гр/мин.
При оценке выхода из облученных клеток во внешнюю среду материала поступали следующим образом. Подвергнутые воздействию у-излу-чения 6*0Со в дозе 311 Гр клеточные суспензии бактерий E. coli B/r в концентрации 108 клеток/мл
инкубировали в изотоническом 0.01 моль/л фосфатном буфере pH 7.0 при 37°С в течение разных сроков. После этого суспензии клеток осаждали в подобном же буфере путем центрифугирования. Концентрацию материала в супернатанте измеряли при 265 нм на спектрофотометре "СФ-46" ("ЛОМО", С.-Петербург).
При исследовании влияния материала, вышедшего во внешнюю среду из облученных клеток, на жизнеспособность интактных и облученных бактерий часть суспензий клеток, подвергнутых воздействию у-излучения 60Со в разных дозах, освобождали от этого материала центрифугированием и ресуспендированием осадка клеток в изотоническом фосфатном буфере, а другую часть облученных суспензий клеток оставляли в буфере, в котором осуществляли облучение. После этого обе части клеточной суспензии инкубировали в течение разных сроков в изотоническом фосфатном буфере при 37°С.
При определении влияния величины инокулу-ма бактерий на интенсивность их отмирания, либо их размножения в изотоническом фосфатном буфере использовали клеточные суспензии в концентрации 105-108 клеток/мл. Выбор верхнего предела диапазона концентраций суспензий клеток, превышающего на 2 порядка "М"-концен-трацию, обусловлен тем, что в этих условиях микроорганизмы не способны к размножению в жидкой среде Тем самым создавали условия для исследования феномена реактивации бактерий, подвергнутых воздействию проникающей радиации [1]. Выбор нижнего предела диапазона концентраций клеточных суспензий обусловлен тем обстоятельством, что именно эта концентрация является крайней, ниже которой уже возможно клеточное размножение в жидких непитательных средах, потенциально способное имитировать ранее обнаруженный феномен реактивации клеток в фосфатном буфере после воздействия ионизирующей радиации [1].
Выживаемость клеток определяли с помощью капельного метода макроколоний [5]. Подробности методики облучения и культивирования микроорганизмов представлены в работе [1].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1 представлены кривые зависимости жизнеспособности интактных бактерий E. coli B/r от продолжительности инкубации микроорганизмов при 37°С в изотоническом фосфатном буфере с различной концентрацией клеток. Видно, что в процессе инкубации в фосфатном буфере бактерии в суспензии с концентрацией 105-108 клеток/мл отмирают. При этом интенсивность отмирания снижается с уменьшением концентрации клеточной суспензии.
Время инкубации, сут
Рис. 1. Кривые зависимости выживаемости интактных бактерий E. coli B/r от продолжительности инкубации в изотоническом 0.01 моль/л фосфатном буфере pH 7.0 в различных концентрациях: 105 клеток/мл (1); 106 клеток/мл (2); 107 клеток/мл (3); 108 клеток/мл (4).
Следовательно, полученные данные указывают на то, что интактные микроорганизмы в концентрации 105-108 клеток/мл не способны к размножению в фосфатном буфере. Однако это вовсе не означает, что и облученные бактерии при этих концентрациях не способны к размножению в фосфатном буфере, так как эта малопитательная среда может обогащаться вследствие выхода из клеток пластического и (или) энергетического материала [4].
Для оценки интенсивности выхода из облученных клеток во внешнюю среду пластического и (или) энергетического материала исследовали при 265 нм оптическую плотность супернатантов бактерий E. coli B/r, облученных от источника у-радиации 60Co в дозе 311 Гр, после инкубации бактериальных суспензий в фосфатном буфере в течение различных сроков при 37°С.
На рис. 2 представлены кривые зависимости величины оптической плотности при 265 нм материала в супернатантах интактных и облученных бактерий E. coli B/r от продолжительности инкубации при 37°С посевов клеточной суспензии в концентрации 108 клеток/мл. Видно, что по сравнению с интактными клетками бактерий, из облученных клеточных суспензий этого штамма выходит в изотонический фосфатный буфер материал, оптически активный при 265 нм. Макси-
Оптическая плотность, отн. ед.
Время инкубации, мин
Рис. 2. Кривые зависимости величины оптической плотности при 265 нм материала в супернатантах ин-тактных (1) и облученных от у-источника 60Со (доза 311 Гр) бактерий E. coli В/г (2) от продолжительности инкубации при 37°С клеточных суспензий в концентрации 108 клеток/мл.
мум этого выхода наступает после 60 мин инкубации облученных микроорганизмов. Эти данные согласуются и с данными литературы [4].
При оценке влияния подобного материала на размножение либо отмирание интактных микроорганизмов исследовали зависимость выживаемости бактерий E. coli В/г, инкубированных в течение двух суток в изотоническом фосфатном буфере и в аналогичном, содержащем этот материал, от концентрации суспензий клеток (рис. 3).
На рис. 3 видно, что с увеличением концентрации клеток выживаемость в обоих вариантах клеточной суспензии снижается. Из этого рисунка также следует, что присутствие в фосфатном буфере материала из облученных клеток, оптически активного при 265 нм, снижает динамику отмирания микроорганизмов при концентрации 106-108 клеток/мл. Кроме того, как это видно на рисунке, при концентрации 105 клеток/мл имеет место даже размножение клеток, обусловленное, по-видимому, наличием в суспензионной жидкости пластического и (или) энергетического материала, выделенного из облученных клеток. Последний факт, таким образом, позволяет предположить, что в основе явления реактивации выживаемости облученных микроорганизмов в дозе, индуцирующей 99-99.9 % гибели клеточной
Концентрация клеточной суспенции, клеток/мл
Рис. 3. Кривые зависимости выживаемости интактных бактерий E. coli В/г от концентрации клеточной суспензии микроорганизмов, инкубированных в течение 2 сут при 37°С в изотоническом 0.01 моль/л фосфатном буфере pH 7.0 (1) и в подобном же буфере, содержащем оптически активный при 265 нм материал из бактерий E. coli В/г, подвергнутых воздействию у-излучения 60Со (доза 311 Гр) (2).
популяции [1], могут лежать процессы клеточного размножения.
Для верификации этого допущения исследовали зависимость выживаемости бактерий E. coli В/г от дозы у-излучения 60Со при непосредственном после облучения посеве бактерий на твердый питательный агар после 2-суточной инкубац
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.