РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2007, том 47, № 2, с. 158-162
МОДИФИКАЦИЯ ^^^^^^^^^^
РАДИАЦИОННЫХ ЭФФЕКТОВ
УДК 582:5391.047
О ВЛИЯНИИ АНТИОКСИДАНТА - АМБИОЛА НА РАДИАЦИОННЫЙ АДАПТИВНЫЙ ОТВЕТ
© 2007 г. Н. Н. Зоз, И. С. Морозова, А. М. Серебряный*
Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля РАН, Москва
Исследовано влияние предварительного облучения в дозе 0.25 Гр и антиоксиданта амбиола на эффекты, вызываемые воздействием у-излучения в дозе 50 Гр в семенах мягкой озимой пшеницы ТгШ-сит aestivum сорта Московская 39. Показано, что облучение семян в малой дозе уменьшает эффективность облучения в ударной дозе - наблюдается адаптивный ответ (АО). Предобработка семян амбиолом снижает эффект ударной дозы 50 Гр по показателям "митотический индекс" и "спонтанная частота клеток с аберрациями хромосом". Постобработка в некоторых из сроков фиксации также обеспечивает протекторный эффект по обоим показателям. Однако суммарно по всем срокам фиксации протекторные свойства зарегистрированы только по показателю "митотический индекс". Оба варианта обработок семян амбиолом усиливают АО. В соответствующих контрольных экспериментах отмечена стимуляция амбиолом митотического индекса, причем и в таких случаях обработка семян антиоксидантом в ранние часы прорастания (в период, соответствующий предобработке в варианте с облучением) более эффективна. Обнаружено, что в координатах митотический индекс - частота клеток с аберрациями через все точки эксперимента можно провести единую регрессионную прямую с коэффициентом корреляции -0.85 (р = 0.002). Это означает, что механизм, по которому формируются АО и протекторный эффект антиоксиданта, един и независим от того, когда действует протектор - до или после облучения в ударной дозе. Это факт указывает также, что протекторный эффект не связан со способностью антиоксиданта перехватывать свободные радикалы и снижать степень радиационного повреждения генома, так как к моменту постобработки объем повреждения генома уже сформирован. Описанные факты согласуются с гипотезой, что у растений независимо от момента воздействия протектора снижение фиксируемой частоты мутаций происходит по механизму стимулируемой репопуляции.
Пшеница, облучение, адаптивный ответ, антиоксидант, амбиол, митотический индекс, частота аберраций.
В серии публикаций, посвященных механизмам адаптивного ответа и антимутагенеза у растений, мы показали, что оба эти эффекта формируются по единому механизму стимулированной репопуляции [1, 2]. В них показано, что различные физические и химические факторы (ионизирующая радиация, химические мутагены, антиок-сиданты) в малой дозе активируют эту систему и при последующем воздействии этих же или иных повреждающих факторов репопуляция защищает геном путем полного замещения в популяции поврежденных клеток неповрежденными вследствие вступления в митотический цикл дополнительных, в норме неделящихся клеток.
Однако во всех указанных выше исследованиях действие фактора, запускающего систему стимулированной репопуляции, предшествовало действию основного повреждающего агента в большой, ударной дозе. Представлялось интерес-
*Адресат для корреспонденции: 119991 Москва, ГСП-1, Косыгина, 4, Институт биохимической физики РАН; тел.: (495) 939-74-81; факс (495) 137-41-01; e-mail: amserebr@sky. chph.ras.ru.
ным выяснить, сохраняются ли закономерности защитного действия слабых воздействий в тех случаях, когда оно происходит после воздействия фактора в ударной дозе, в момент, когда объем первичных повреждений генома уже сформирован. Поэтому в представленной работе сравниваются закономерности влияния пред- и постобработок семян антиоксидантом амбиолом на выраженность радиационного адаптивного ответа у семян пшеницы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
В работе использованы семена мягкой пшеницы ТгШсиш аевйуит сорта Московская 39. Антиоксидант амбиол (дихлоргидрат 2-метил-5-гид-рокси-4-(диметиламинометил)-бензамидазола) синтезирован в Институте биохимической физики РАН.
Общий контроль. Семена выдерживали 36 ч в воде, затем проращивали при 24°С и по стандартной методике [3] анализировали митотическую активность и частоту клеток с аберрациями в ана-
фазе первого митоза в апикальной меристеме первичных корешков проростков при фиксации материала через 45, 48, 51, 54 и 57 ч после начала намачивания семян.
Для каждого варианта использовали не менее 10 корешков. На каждый час фиксации просматривали более 2000 клеток для определения мито-тической активности и около 200 клеток для измерения доли аберрантных клеток.
Предобработка антиоксидантом. Семена 12 ч замачивали в 0.0005%-ном растворе антиоксидан-та, подвергали воздействию у-излучения в
дозе 0.25 Гр с мощностью дозы 3.5 Гр/мин. После этого семена выдерживали 12 ч на влажной фильтровальной бумаге при 24°С и облучали на том же источнике в дозе 50 Гр, с той же мощностью дозы. Затем повторно выдерживали 12 ч на влажной фильтровальной бумаге при 24°С, проращивали при той же температуре и фиксировали.
Контрольные эксперименты проводили по этой же методике, но изучали соответственно индивидуальное действие каждого фактора (амбио-ла, облучения в дозе 0.25 или 50 Гр) или совместное попарное действие каждого из факторов.
Постобработка антиоксидантом. Семена 12 ч замачивали в воде, затем облучали в дозе 0.25 Гр при описанных выше условиях. После этого семена выдерживали 12 ч на влажной фильтровальной бумаге при 24°С и облучали в дозе 50 Гр. Затем семена замачивали 12 ч в 0.0005%-ном растворе антиоксиданта, проращивали при 24°С и фиксировали.
Контрольные эксперименты проводили по этой же методике, но исследовали соответственно индивидуальное действие каждого фактора (амбиола, облучения в дозе 0.25 или 50 Гр) или их совместное действие попарно.
Далее проводили опыты так же, как в варианте с предобработкой.
Достоверность различий оценивали по критериям Стьюдента, %2 или Фишера; различия признавались достоверными при р < 0.05. Расчеты коэффициентов корреляции, параметров уравнений линейной регрессии, построение соответствующих прямых проводили с использованием пакета статистических программ Statistica для персонального компьютера.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
На рис. 1, а, б представлены итоги измерения частоты клеток с аберрациями хромосом и мито-тического индекса в проростках пшеницы в контроле и эксперименте с облучением семян в дозе 50 Гр в зависимости от часа фиксации. Видно, что облучение в этой дозе не вызывало задержки ми-тотического индекса, и что он мало зависит от времени фиксации. Частота аберрантных клеток
Частота аберрантных клеток, %
30 28 26 24 22 20 18 16 14 12 10
45 48 51 Митотический индекс, %
54
57
10 9 8 7 6 5 4 3
- п 1 0 6
- О о
□ 2 □
1 □ □ 1 | 1
45 48 51 54 57 Время фиксации, ч
Рис. 1. Зависимость митотического индекса (1) и частоты аберрантных клеток (2) от часа фиксации клеток: а - в варианте с облучением в дозе 50 Гр, б - в контроле.
максимальна на первый срок фиксации и в дальнейшем лишь монотонно слегка снижается. Такая кинетика позволяет при обсуждении результатов пользоваться средними значениями частот за весь клеточный цикл, приведенными в табл. 1 и 2.
Воздействие амбиола в начальной стадии замачивания семян (период, который в последующих вариантах с модификацией эффекта ударной дозы облучения предшествует облучению), а также облучение семян в малой дозе 0.25 Гр достоверно (р < 0.001) усиливают деление клеток в проростках, повышая митотический индекс с 8.68 ± ±0.22 до 10.4 ± 0.21 и 10.9 ± 0.22 соответственно (табл. 1). Обработка семян амбиолом в поздний период намачивания семян не влияет на митотический индекс (табл. 1). Параллельно достоверно снижается и частота аберратных клеток в вариантах с обработкой амбиолом в ранней стадии замачивания семян или после облучения в малой дозе и не меняется в варианте с обработкой амбиолом в поздний период намачивания семян (табл. 2).
Адаптирующее облучение в дозе 0.25 Гр снижает эффект последующего облучения в высо-
2
1
Таблица 1. Митотический индекс в проростках семян пшеницы после облучения в дозах 0.25, 50 и 0.25 Гр + 50 Гр, а также в условиях применения амбиола (суммарно по всем часам фиксации)
Вариант обработки Просмотрено клеток Митотический индекс, % Р
всего из них в фазе митоза
Вода (контроль) 15972 1386 8.68 ± 0.22 -
Амбиол "до" 20061 2096 10.4 ± 0.21 <0.001а
Амбиол "после" 12484 1160 9.29 ± 0.26 >0.05а
0.25 Гр 20049 2186 10.9 ± 0.22 <0.001а
50 Гр 24078 1229 5.10 ± 0.14 <0.001а
Амбиол + 50 Гр 11606 803 6.92 ± 0.23 <0.001ь
50 Гр + амбиол 16921 1216 7.19 ± 0.18 <0.001ь
0.25 Гр + 50 Гр 23515 1415 6.02 ± 0.15 <0.001ь
Амбиол + 0.25 Гр + 50 Гр 18328 1886 10.3 ± 0.22 <0.001с
0.25 Гр + 50 Гр + амбиол 22202 1888 8.50 ± 0.19 <0.001с
Примечание. Индекс а - по сравнению с контролем, ь - по сравнению с эффектом ударной дозы 50 Гр, с - по сравнению с эффектом облучения в дозах 0.25 + 50 Гр.
Таблица 2. Частота аберрантных клеток в проростках пшеницы после облучения семян в дозах 0.25, 50 и 0.25 Гр + 50 Гр и в условиях воздействия амбиола (суммарно по всем часам фиксации)
Вариант обработки Просмотрено клеток Частота аберрантных клеток,% Р
в фазе митоза из них с аберрациями
Вода (контроль) 1253 39 3.11 ± 0.49 -
Амбиол "до" 1753 17 0.97 ± 0.23 <0.001а
Амбиол "после" 887 28 3.16 ± 0.59 -
0.25 Гр 1465 9 0.61 ± 0.20 <0.001а
50 Гр 945 255 27.0 ± 1.4 <0.001а
Амбиол + 50 Гр 862 183 21.2 ± 1.4 <0.01ь
50 Гр + амбиол 804 195 24.2 ± 1.5 >0.05ь
0.25 Гр + 50 Гр 1162 245 21.1 ± 1.2 <0.01ь
Амбиол + 0.25 Гр + 50 Гр 1097 152 13.8 ± 1.0 <0.001с
0.25 Гр + 50 Гр + амбиол 1188 205 17.2 ± 1.1 <0.05с
Примечание. Индекс а - по сравнению с контролем, ь - по сравнению с эффектом ударной дозы 50 Гр, с - по сравнению с эффектом облучения в дозах 0.25 + 50 Гр.
кой, ударной дозе 50 Гр: уменьшается депрессия митотического индекса, и он достоверно возрастает с 5.10 ± 0.14 до 6.02 ± 0.15 (р < 0.001), в то время как частота аберрантных клеток также достоверно снижается с 27.0 ± 1.4 до 21.2 ±
± 1.4 (р < 0.01). Это означает, что по обоим показателям наблюдается адаптивный ответ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.