УДК 612+612.46+612.461:613.693
ОБНАРУЖЕНИЕ БЕЛКОВ ТКАНЕЙ ПОЧЕК И МОЧЕВЫВОДЯЩЕЙ СИСТЕМЫ В МОЧЕ ЧЕЛОВЕКА ПОСЛЕ КОСМИЧЕСКОГО ПОЛЕТА
© 2013 г. Л. Х. Пастушкова1, К. С. Киреев2, А. С. Кононихин3, 4, Е. С. Тийс5, И. А. Попов3, 4, И. В. Доброхотов1, В. А. Иванисенко5, В. Б. Носков1, И. М. Ларина1, Е. Н. Николаев3, 4
1ФГБУНГНЦРФ — Институт медико-биологических проблем РАН, Москва 2 ФГБУ — НИИЦПК им. Ю.А. Гагарина, Московская область 3 Учреждение РАН Институт биохимической физики им. Н.М. Эмануэля, Москва 4 Учреждение РАН Институт энергетических проблем химической физики, Москва 5 Учреждение СО РАН Институт цитологии и генетики Российской академии наук, Новосибирск
Поступила в редакцию 12.09.2012 г.
С помощью протеомной технологии исследован белковый состав (протеом) мочи здорового человека в обычных, физиологических условиях и после полугодовых космических экспедиций. Показано, что после полетов у космонавтов в моче выявляются специфические минорные белки, которые удалось идентифицировать и отнести к белкам, исходящим из почек и мочевыводящих путей.
Ключевые слова: протеом мочи, космический полет, здоровые люди, водно-солевой обмен.
БО1: 10.7868/80131164613050123
Несмотря на заметный прогресс в понимании механизмов адаптационных процессов при воздействии условий космического полета (КП), еще остаются малоисследованные области. Изменения, происходящие во время КП в организме, затрагивают все системы, в том числе и белковый состав крови и мочи, называемый протеомом [1—3]. Изучение изменений уровня белков и регулятор-ных пептидов в жидкостях тела человека с помощью новых и высокотехнологичных методов (про-теомный анализ) в обычных, физиологических условиях, а также после воздействия невесомости, будет способствовать пониманию тонких молекулярных механизмов поддержания водно-солевого гомеостаза.
Исследование протеома мочи имеет ряд преимуществ, по сравнению с изучением состава крови, поскольку белковые компоненты мочи при хранении более стабильны, этот биоматериал доступнее и содержит малые концентрации мажорных белков, таких как альбумины и глобулины. Следует отметить, что отношение к самому факту протеинурии в физиологии в последнее время стало меняться. Долгое время считалось, что белки вообще отсутствуют в моче здорового человека, однако, с развитием современных методов детектирования, было признано, что с мочой все-таки экскретируются определенные белки, количество и состав которых изменяется при патологических
состояниях. В последнее десятилетие использование протеомного анализа мочи при диагностике заболеваний и/или при мониторинге лечения позволило накопить более 20000 композиций так называемых "минорных" белков мочи, свойственных различным патологическим состояниям [3, 4]. В настоящее время протеомные технологии способны не только значительно снизить количественный порог определяемого белка, но и проанализировать состав сложной смеси экскретируе-мых с мочой белков и пептидов.
Закономерно возникает интерес к изучению белкового состава мочи здорового человека при том или ином воздействии и, в частности, после космического полета, поскольку факторы орбитального полета вызывают закономерные сдвиги в состоянии водно-электролитного обмена и функции почек [1]. Изучение белкового состава мочи с помощью новых методических подходов (протео-мики) будет способствовать пониманию механизмов адаптации и гомеостаза, а, может быть, и поможет внести коррективы в современные методы профилактики.
Целью настоящей работы было изучение с помощью новейших протеомных технологий белкового состава мочи космонавтов, совершивших продолжительные полеты на борту Международной космической станции (МКС).
99
7*
МЕТОДИКА
Исследование выполнено в рамках эксперимента "Протеом". Обследовано 10 российских космонавтов (в возрасте от 35 лет до 51 года), выполнивших космические полеты длительностью от 169 до 199 суток на борту МКС. Сбор биологических образцов осуществлялся до полета, а также на 1-е и 7-е сутки после приземления. Каждый раз сбор мочи осуществлялся в дневное время суток после завтрака (2-я фракция суточного сбора).
Эта фракция была признана наименее вариабельной по белковому составу, иными словами, наиболее пригодной для протеомных исследований [5]. В качестве контрольной группы таким же образом были обследованы дублеры космонавтов (6 человек). Эти лица относились к той же возрастной группе, проходили аналогичную подготовку, имели тот же рацион и находились в тех же условиях, что и космонавты. От дублеров космонавтов образцы биологического материала были получены дважды в интервалы времени, соответствующие пред- и послеполетному сбору биоматериала у космонавтов.
Образцы собранного биоматериала центрифугировали (2000 g в течение 10 минут при 0—4°C) и отбирали супернатант, дальнейшая пробоподго-товка образцов к масс-спектрометрии осуществлялась так, как описано ранее [6]. Хромато-масс-спектрометрический анализ минорных белков проводился на системе, состоящей из хроматографа Agilent 1100 (Agilent Technologies Inc., США) и масс-спектрометра LTQ-FT Ultra (Thermo, Германия). Для градиентной хроматографии использовали колонку, изготовленную в лаборатории проф. Е.Н. Николаева с использованием капилляра-эм-митера (Pico-tip, New Objective Inc., США), способом, описанным Ишихама и соавт. [7].
Масс-спектры продуктов хроматографии находились в диапазоне от 300 до 1600 Th m/z. Каждый образец мочи был проанализирован трижды и для последующего анализа отобраны лишь те белки, которые были обнаружены в двух или трех повторах. Биоинформационный подход в анализе лабораторных результатов состоял в том, что список из полученных масс белков и их фрагментов использовался для поиска и идентификации белков по базе данных IPI-human (международный индекс белка) при помощи программы Mascot (Matrix Science, версия 2.0.04, Великобритания) по следующим критериям: 1 — enzyme—trypsin; 2 — peptide tol. 5 ppm; 3 - MS/MS tol. 0.5 Da. В списке белков, полученном в результате Mascot-поиска, достоверными считались только те белки, для которых были идентифицированы хотя бы 2 пептида с рейтингом более 24. Для автоматического отбора и сравнительного анализа белков, результаты Mas-cot-поиска обрабатывались с помощью специальной программы, разработанной Д.М. Автономо-
вым с соавт. [8]. Для определения места образования и функции выявленных белков, а также для анализа биологических процессов, в которых они участвуют, использовались следующие биоинформационные ресурсы: UniProt KB, UniProt, TiGER (Tissue-specific Gene Expression and Regulation), Gene Ontology. Из этих баз данных была извлечена информация о соответствии между регистрируемыми IPI и тканями на основе тканеспецифиче-ской экспрессии генов для 30 различных тканей человека.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В результате хромато-масс-спектрометриче-ского анализа всех образцов мочи космонавтов и дублеров было найдено 238 различных белков (по номенклатуре UniProtKB). В данной методике нами использовалась оптимальная рабочая концентрация белка в пробе в пределах 0.1—1.0 мг/мл, что не является нижним пределом чувствительности метода. Высокая чувствительность протеомного анализа позволила полностью оценить белковую композицию мочи, при этом из общего числа обнаруженных белков (238) тканевая принадлежность известна для 129, согласно базе TiGER. Причем среди белков, присутствующих в моче, собранной в фоновом, дополетном периоде, определенную тканевую принадлежность имеют 92; а в первые послеполетные сутки — 90. К 7-м суткам периода реадаптации таких белков было 95. Тканевая принадлежность была также определена для 81 белка, выявленного у дублеров.
Из общего числа обнаруженных белков (238) с помощью базы данных TiGER было идентифицировано 18 белков, принадлежащих к почечной ткани. Все они были разделены на три группы: I группа — постоянно обнаруживаемые как в условиях обычной жизнедеятельности, так и после полета;
II группа — отличающиеся большой вариабельностью и среди космонавтов, и в группе дублеров; и
III группа — это белки, чаще выявляемые после космического полета (таблица).
К I группе белков, источником которых являлась почечная ткань, относятся: кубулин (CUBN), мегалин (LRP2), калликреин-1 (KLK1), кинино-ген-1 (KNG1), эпидермальный фактор роста (EGF), остеопонтин (OSTP), витамин Z-зависимый протеин Z (PROZ) и уромодулин (UROM). К группе "почечных" белков, отличающихся большой вариабельностью (группа II), были отнесены: субъединица гамма Na/K-АТФазы (ATP1G1), B-дефен-зин 1 (BD01), дипептидилпептидаза-4 (DPP4), мальтаза-глюкоамилаза (MGA), кадгерино-подоб-ный белок (MUCDL), нейтральная эндопептидаза (NEP) и васкулоадгезивный белок 1 (VCAM1). И только три почечных белка (группа III), по-видимому, отражали влияние условий космического
Минорные белки в моче космонавтов и дублеров до и после космического полета (КП)
Дублеры (п = 6) Космонавты (п = 10)
Белки почечной ткани 1* 2** До полета + 1 сутки после КП +7 сутки после КП
Группа I
сиви, кубулин есть есть есть есть есть
EОF, эпидермальный фактор роста есть есть есть есть есть
КЬК1, калликреин 1 есть есть есть есть есть
КЫО1, кининоген-1 есть есть есть есть есть
ЬЯР2, мегалин есть есть есть есть есть
08ТР, остеопонтин есть есть есть есть есть
PR0Z, витамин К-зависимый протеин 2 есть есть есть есть есть
иЯОМ, уромодулин есть есть есть есть есть
Группа II
ЛТЫО, у-субъединица №/К АТФазы нет есть нет нет нет
BD01, В-дефензин 1 нет нет есть есть есть
DPP4, дипепти-дилпептидаза IV нет есть есть нет есть
МОЛ, мальтаза-глюкоамилаза нет нет есть есть нет
MUCDL, кадгерино-подобный белок есть нет есть нет нет
МЕР, нейтральная эндопептидаза нет нет есть нет нет
УСАМ1, васкулоадгезивный белок 1 нет нет есть есть есть
Группа III
АЕАМ, афамин нет нет нет есть нет
АМРЕ, амино-пептидаза А нет нет нет нет есть
ЛQP2, аквапорин-2 нет нет нет есть нет
Примечание: 1* — обследование дублеров, одновременное со сбором фоновых данных космонавтов перед полетом; 2* — обследование дублеров, по времени отстоящее от первого (1*), на продолжительно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.