ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 6, с. 447-452
= МЕДИЦИНСКАЯ ЭМБРИОЛОГИЯ =
УДК 576.3
ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА КОРРЕЛИРУЕТ СО СНИЖЕНИЕМ ЧАСТОТЫ ФОРМИРОВАНИЯ БЛАСТОЦИСТ И ЧАСТОТЫ ИМПЛАНТАЦИИ ЭМБРИОНОВ ПРИ ЭКСТРАКОРПОРАЛЬНОМ ОПЛОДОТВОРЕНИИ
© 2011 г. А. С. Цибизов, А. Г. Абдулмеджидова, К. В. Краснопольская*,
З. С. Гаджиева, А. А. Кущ
ФГУ "НИИвирусологии им. Д.И. Ивановского"Минздравсоцразвития РФ 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16 *Отделение репродукции ГУЗ МОНИИАГ 125101 Москва, 2-ой Боткинский проезд, д. 5, корп. 5 E-mail: anisat2011@gmail.com Поступила в редакцию 14.02.11 г. Окончательный вариант получен 11.04.11 г.
Проведен сравнительный анализ развивающихся эмбрионов человека при лечении бесплодия методом экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) в двух группах пациентов: в группе I (n = 28) у мужского партнера во фракции подвижных сперматозоидов был обнаружен вирус простого герпеса (ВПГ), в группе II (n = 103) — ВПГ в сперматозоидах не был обнаружен. Оценивали количество оплодотворенных яйцеклеток, дробящихся эмбрионов и бластоцист, а также показатели частоты имплантации эмбрионов и частоты наступления беременности в циклах ЭКО. Установлено, что присутствие ВПГ в сперматозоидах не влияло на эффективность оплодотворения и дробления зигот. В то же время при инфицировании вирусом мужских гамет частота формирования бластоцист была снижена в 2 раза (р = 0.015), частота имплантации эмбрионов и частота наступления беременности — в среднем, в 5 раз (р = 0.01 и р = 0.016 соответственно). На основании полученных данных сделан вывод о негативном влиянии ВПГ-инфекции мужских гамет на ранние стадии развития эмбрионов и наступление беременности при использовании методов вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ).
Ключевые слова: сперматозоиды человека, эмбрионы человека, вирус простого герпеса, экстракорпоральное оплодотворение, имплантация, наступление беременности.
Одна из первых работ, свидетельствующих о присутствии вируса простого герпеса (ВПГ) в клетках мужской репродуктивной системы, была опубликована более 30 лет назад (Deture et al., 1976). В экспериментах in vitro было установлено, что ВПГ способен инфицировать и реплицироваться в тестикулярных клетках (Csata, Kulcsar, 1991). Присутствие вируса в различных фракциях эякулята мужчин, в том числе и в сперматозоидах, позже было подтверждено культуральным методом, иммуноцитохимически, методом полимераз-ной цепной реакции (ПЦР) и методами гибридизации in situ и ПЦР in situ (Moore et al., 1989; Kotro-nias, Kapranos, 1998; Wald et al., 1999; Dejucq, Jegou, 2001; Брагина и др., 2000; Бочарова и др., 2003; Be-zold et al., 2007; Климова и др., 2010). Получены данные о повышенной частоте определения ВПГ в мужских половых клетках при спонтанных абортах у жен и в случаях невынашивания беременности (Бочарова и др., 2006). Важно отметить, что во всех
изученных случаях у обследованных лиц не было отмечено клинических симптомов герпесвирус-ной инфекции. Таким образом, опубликованные данные указывают на связь между бессимптомной ВПГ-инфекцией и нарушением функции репродуктивной системы. Однако многие вопросы в этой области остаются невыясненными. Так, не доказана внутригаметная локализация полноценных вирусных частиц в зрелых мужских половых клетках, не установлена способность инфицированных ВПГ сперматозоидов участвовать в оплодотворении ооцитов и в передаче вируса эмбрионам через ВПГ-содержащие сперматозоиды. Недостаточно изучены механизмы противовирусной защиты в ооцитах человека, которые могли бы эффективно сдерживать развитие герпесвирусной инфекции. Это означает, что процессы, приводящие к снижению фертильности у человека при ВПГ инфекции, остаются не раскрытым. Цель настоящего исследования заключалась в оценке вли-
448
ЦИБИЗОВ и др.
яния бессимптомной ВПГ-инфекции у мужчин на оплодотворение и ранние стадии эмбриогенеза человека при экстракорпоральном оплодотворении.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Пациенты. Обследовали 131 супружескую пару, обратившихся в лечебно-диагностический центр "Евро-Клиник" (г. Москва) и в отделение репродукции ГУЗ МОНИИАГ (г. Москва) в течение 2008 и 2009 гг. для лечения бесплодия методом ЭКО. Критериями включения в экспериментальную группу женщин являлись: возраст не менее 19 и не более 37 лет, индекс массы тела не менее 19 кг/м2 и не более 25 кг/м2, базальный уровень фолликуло-стимулирующего гормона (ФСГ) не более 9 МЕ/л, отсутствие генетических и эндокринных нарушений и системных заболеваний воспалительного характера. Критериями исключения мужчин были отсутствие сперматозоидов в эякуляте и присутствие маркеров инфекционных заболеваний бактериально-вирусной природы (кроме маркеров ВПГ-инфекции). Ни в одном случае у обследованных пациентов в анамнезе не было клинического эпизода ВПГ-инфекции. Определение ВПГ проводили в выделенной фракции зрелых, активно подвижных и морфологически нормальных сперматозоидов.
Выделение фракции активно подвижных сперматозоидов из эякулята проводили согласно рекомендациям ВОЗ (WHO, 2010) с использованием сертифицированных коммерческих сред фирмы COOK (Австралия).
Детекция ДНК ВПГ проводилась методом стандартной ПЦР и ПЦР in situ. Стандартный вариант ПЦР выполняли с использованием сертифицированных коммерческих наборов ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора. Для выделения ДНК использовали наборы ДНК-сорб-А-М и ДНК-сорб-В. Амплификацию ДНК проводили с использованием комплекта реагентов "АмплиСенс HSV 1.2 типов" на термоциклере "Терцик" (ДНК-Технология, Россия) по температурной программе, рекомендованной изготовителем тест-систем.
Для проведения ПЦР in situ препараты готовили на стеклах с адгезивным покрытием (Histobond, Германия). По 150 мкл из фракции подвижных сперматозоидов наносили на стекла, центрифугировали в течение 5 мин при 1500 об/мин в цито-центрифуге 5804R (Эппендорф, Германия), высушивали на воздухе и фиксировали в 10% формалине в течение 4 часов. После двукратной отмывки в 0.05 М трис-НС1-буфере, препараты обрабатывали протеиназой К ("DAKO", Дания) 30 мин при 37°С. Добавляли амплификационную смесь, содержащую биотинилированные праймеры и проводили амплификацию в термоциклере Т1 ("Biometra GmbH", Германия). Проявление реакции осуществляли с использованием комплекса биотин-стрептавидин-пероксидаза ("DAKO", Дания) и
диаминобензидина ("Sigma", США). Подсчитывали не менее 2000 сперматозоидов в препаратах от каждого пациента и вычисляли долю клеток, содержащих метку ДНК ВПГ, которую выражали в процентах.
Экстракорпоральное оплодотворение. Стимуляция функции яичника проводилась по стандартному длинному протоколу с применением агони-стов гонадотропин рилизинг гормона (а-ГнРГ) и гонадотропинов. Оплодотворение клеток методом ЭКО и/или методом введения сперматозоида в цитоплазму ооцита (ИКСИ) проводили по протоколам, описанным в работе Ван Ландэт (Van Landuyt et al., 2005). Через 18 часов после соединения гамет в условиях in vitro определяли число пронуклеусов в зиготах. Затем, через каждые 24 ч анализировали дробление и морфологию эмбрионов, которое оценивали по количеству бластомеров, количеству ядер в одном бластомере и наличию или отсутствию фрагментации бластомеров. Эмбрионы культивировали с использованием коммерческих сертифицированных сред фирмы СООК (Австралия), в условиях 6% СО2 и 37°С. Полученные эмбрионы переносили в полость матки на второй-третий день развития. Для переноса отбирали не более 2—3 эмбрионов наиболее высокого качества. К ним относили эмбрионы, содержащие 4 и 8 бла-стомеров на 2 и 3 сутки соответственно без фрагментации и полинуклеарности. Оставшиеся после переноса эмбрионы культивировали до пятого дня развития и криоконсервировали на стадии бласто-цисты.
Для оценки результатов ЭКО вычисляли следующие параметры:
1. Индекс оплодотворения как соотношение общего числа полученных у пациенток яйцеклеток к числу оплодотворившихся ооцитов (зигот).
2. Индекс дробления как отношение количества всех зигот к общему количеству дробившихся эмбрионов.
3. Частоту достижения эмбрионами стадии бла-стоцисты по числу бластоцист на пятый день развития эмбриона.
4. Частоту имплантации эмбрионов (ЧИЭ) по соотношению количества развивающихся плодных яиц к общему числу перенесенных эмбрионов.
5. Частоту наступления беременности (ЧНБ) как количество случаев наступления клинической беременности при расчете на одну процедуру переноса эмбрионов.
Статистическую обработку результатов проводили с помощью компьютерной программы "BIOSTAT". Достоверность различий оценивали по критерию Стьюдента—Фишера — х2, различия считали достоверными приp < 0.05.
ОБНАРУЖЕНИЕ ВИРУСА ПРОСТОГО ГЕРПЕСА В СПЕРМАТОЗОИДАХ ЧЕЛОВЕКА 449
Рис. 1. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека.
Цитологический препарат сперматозоидов, выделенных из фракции подвижных клеток эякулята пациентов с бесплодием. Окраска гематоксилином Караччи. Гаметы, содержащие ДНК ВПГ, обозначены стрелками. Реакция ПЦР in situ. Увеличение 400.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Детекцию ДНК ВПГ в сперматозоидах методом ПЦР проводили у 131 пациента, что позволило оценить частоту встречаемости ВПГ в мужских гаметах. У 64 пациентов из этой группы исследование вирусного генома проводили дополнительно методом ПЦР in situ, который позволяет оценить количество инфицированных клеток в цитологическом препарате. В целом, частота обнаружения ДНК вируса в сперматозоидах у обследованных пациентов методами ПЦР и ПЦР in situ составила 21.4% (28/131).
Подсчет ПЦР-позитивных мужских клеток показал, что доля инфицированных сперматозоидов в препаратах от разных пациентов различалась почти в 10 раз — от 0.25 до 20%, и в среднем составляла 2.8%. На рис. 1 можно видеть сперматозоиды, содержащие метку ДНК ВПГ, выявленную методом ПЦР in situ. Следует отметить, что до 80% сперматозоидов, содержавших геномную ДНК ВПГ, имели нарушение строения головки (макроголовки, микроголовки и аморфное строение головки).
По результатам выявления вирусной ДНК пациенты (n = 131) были разделены на две группы. В группу I вошли пациенты (n = 28), в подвижных сперматозоидах кото
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.