ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 5, с. 309-319
ОБЗОР
УДК 577.95;575;592/599
ОБОЛОЧКИ ПРЕИМПЛАНТАЦИОННЫХ ЗАРОДЫШЕЙ МЛЕКОПИТАЮЩИХ КАК МИШЕНЬ РЕПРОДУКТИВНЫХ ТЕХНОЛОГИЙ
© 2012 г. И. Н. Рожкова1, Е. Ю. Брусенцев1, С. Я. Амстиславский1 2
1 Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, проспект Лаврентьева, д. 10 2 Новосибирский государственный университет 630090 Новосибирск, ул. Пирогова, д. 2 E-mail: amstis@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 28.09.11 г. Окончательный вариант получен 16.11.11 г.
В обзоре описано строение и функция оболочек ооцитов и доимплантационных зародышей млекопитающих. Для успешного проведения замораживания эмбрионов и, особенно, редеривации необходима целостность оболочек зародыша. В то же время в некоторых случаях при проведении ЭКО или при замораживании эмбрионов некоторых видов млекопитающих результаты могут улучшаться, если оболочки перфорируют, нарушая их целостность. Рассмотрены современные репродуктивные технологии, такие как замораживание эмбрионов, экстракорпоральное оплодотворение, ICSI, искусственный хэтчинг, иммуноконтрацепция и редеривация, и роль оболочек ооцитов и ранних зародышей в контексте этих технологий. Рассмотрены особенности проведения этих технологий у разных видов млекопитающих с акцентом на роль оболочек в этом процессе.
Ключевые слова: оболочки эмбрионов, криоконсервация эмбрионов, ЭКО, искусственный хэтчинг, иммуноконтрацепция, редеривация.
В последнее время оболочкам яйцеклеток (ооцитов) и доимплантационных зародышей уделяют большое внимание (Denker, 2000; Men-khorst, Selwood, 2008; Van Soom et al., 2010). Одной из основных оболочек, которая характерна для всех преимплантационных эмбрионов млекопитающих, является zona pellucida, или, как ее называют в русскоязычной литературе, прозрачная оболочка (Амстиславский и др., 1991; Rankin et al., 2000; Denker, 2000; Menkhorst, Selwood, 2008). Эта структура формируется у млекопитающих ооцитом и окружающими его фолликулярными клетками, являясь впоследствии, после овуляции и оплодотворения ооцита, естественным барьером между эмбрионом и окружающей средой; эта основная оболочка играет важнейшую роль в оплодотворении яйцеклетки (ооцита) и последующем развитии эмбриона и сохраняется у большинства видов млекопитающих до стадии поздней бластоцисты (Denker, 2000; Bedford, 2004; Van Soom et al., 2010). Именно благодаря наличию zona pellucida размер эмбриона на преим-плантационных стадиях развития меняется у большинства млекопитающих незначительно (Senger, 2003). Исключение составляют предста-
вители семейства хищных (Amstislavsky, 2009), а также кролики (Boving, 1957) и лошади (Bet-teridge, 1989). Однако у кролика и лошади, а также некоторых других животных наряду с прозрачной оболочкой (или вместо нее) на определенной стадии преимплантационного развития появляются дополнительные оболочки (Boving, 1957; Bet-teridge, 1989; Denker, 2000; Menkhorst, Selwood, 2008), состав и свойства которых существенно отличаются от zona pellucida. Успех многих современных репродуктивных технологий зависит от свойств оболочек преимплантационных эмбрионов (Montag et al., 2000; Papanikolaou et al., 2008; Kawase et al, 2009; Van Soom et al., 2009; Sills, Palermo, 2010; Van Soom et al., 2010). В данном обзоре наибольшее внимание уделено роли оболочек эмбриона в процессах иммуноконтрацепции, реде-ривации, замораживания и криоконсервации, экстракорпорального оплодотворения и некоторых других эмбриотехнологических методах. Наибольшее внимание уделено млекопитающим, хотя в ряде случаев приведены результаты работ, полученные на сумчатых.
Рис. 1. Дробящийся эмбрион мыши (а) и хомячка Кэмпбэлла (б) на 3-й день развития. Стрелкой указана прозрачная оболочка. Эмбрионы были заморожены на программном замораживателе CL8800 (CryoLogic) и после хранения при температуре жидкого азота были разморожены при 38 градусах Цельсия и сфотографированы на инвертированном микроскопе Leica Microsystems DM IL LED.
СТРОЕНИЕ И СВОЙСТВА ZONA PELLUCIDA И ДРУГИХ ОБОЛОЧЕК ПРЕИМЛАНТАЦИОННЫХ ЭМБРИОНОВ МЛЕКОПИТАЮЩИХ
Прозрачная оболочка млекопитающих эластична (Schwartz et al., 1996), снабжена порами (Dudkiewicz, Williams, 1977) и является достаточно прочной барьерной структурой, ограждающей яйцеклетки и эмбрионы от механических и биологических факторов, в частности, от вирусов (Van Soom et al., 2010). Физические свойства zona pellucida, такие как характер пористости, прочность, толщина, проницаемость для воды и других неорганических компонентов и другие характеристики, изменяются в зависимости от ряда факторов: вида животного, стадии развития зародыша, а также зависят от того, получен ли эмбрион in vivo или in vitro (Van Zoom et al., 2010). Толщина прозрачной оболочки и характеристики проницаемости различны у разных видов млекопитающих. Например, у мышей она тонкая (5 мкм), а у свиней толстая и прочная (16 мкм) (Bedford, 2004). Даже в пределах одного таксона могут быть существенные видовые различия характеристик zona pellucida. Так, например, у двух видов грызунов — мыши (Mus musculus) и хомячков Кэмпбэлла (Phodopus campbelli), по нашим наблюдениям, имеются весьма существенные различия в толщине прозрачной оболочки (рис. 1)
Исследования проницаемости zona pellucida ооцитов и зигот мыши показали, что вещества с низкой молекулярной массой могут свободно проходить через прозрачную оболочку (Legge, 1995). Нужно, однако, принять во внимание тот факт, что проницаемость прозрачной оболочки для молекул зависит не только от их размера, но также и от других биохимических или физико-химических факторов, таких как их гидрофиль-
ные/липофильные свойства. Так, например, ли-пиды относительно легко проникают через прозрачную оболочку мыши (Turner, Horobin, 1997).
По химическому составу zona pellucida состоит из гликопротеидов — соединений белков с углеводами и представляет собой внеклеточный глико-каликс. В образовании прозрачной оболочки ооцитов и эмбрионов млекопитающих принимают участие четыре гликопротеида: ZP1, ZP2, ZP3 и ZP4, хотя не все виды животных имеют в zona pellucida этот набор целиком. Некоторые авторы используют другие обозначения для этих глико-протеидов: ZPA, ZPB, ZPC (Martinez, Harris, 2000; Delves et al., 2002b; Naz et al., 2005; Eade et al., 2009). Как было показано на лабораторной мыши, молекулы гликопротеидов ZP2 и ZP3 соединяются друг с другом попеременно и образуют цепочки, соединенные друг с другом через "мостики" (состоящие из молекул ZP1), в результате чего образуется структура, похожая на сеть (Was-sarman, 1988). ZP2 и ZP3 играют большую роль в процессах оплодотворения, причем у мышей и большинства других видов млекопитающих ZP3 выступает в роли рецептора при взаимодействии сперматозоида и яйцеклетки (Vazquez et al., 1989; Hinsch et al., 1994). Углеводные части этого глико-протеида выступают в качестве видоспецифич-ных лигандов для связывания со сперматозоидами и у разных видов различаются по химическому составу (Moller et al., 1990; Nagdas et al., 1994).
У мышей прозрачная оболочка состоит лишь из трех гликопротеидов: ZP1, ZP2, ZP3 (Wassar-man, 1988; Rankin et al., 2000). В исследованиях на нокаутных линиях мышей, у которых был произведен избирательный нокаут соответствующих генов и один из этих гликопротеидов не экспрес-сировался, была выявлена роль каждого из них в процессе оплодотворения яйцеклетки и в развитии зародыша. Было установлено, что важней-
шую роль в процессе оплодотворения яйцеклеток мышей играет гликопротеид ZP3 (Liu et al., 1996; Rankin et al., 2000).
Поскольку у млекопитающих оплодотворение моноспермное, то для того чтобы эмбрион развивался нормально, в яйцеклетку должно попасть не более одного сперматозоида (Soupart, Strong, 1975). После проникновения сперматозоида структура zona pellucida меняется, и эти изменения являются частью сложного механизма, осуществляющего блок полиспермии и препятствующего проникновению более одного сперматозоида в яйцеклетку (Soupart, Strong, 1975). Данный механизм заключается в общем случае в том, что в результате высвобождения содержимого кортикальных гранул от гликопротеидов (ZP2 и ZP3) отщепляются углеводные остатки, что препятствует взаимодействию других сперматозоидов с измененной прозрачной оболочкой (Soupart, Strong, 1975).
Прозрачная оболочка удерживает клетки эмбриона вместе в заданном ею объеме (Van Zoom etal., 2010), и целостность ее является важным фактором на определенных этапах развития зародыша in vivo (Bronson and McLaren, 1970). По мере развития преимплантационных зародышей и движения их по яйцеводу и матке zona pellucida у эмбрионов большинства млекопитающих в большей или меньшей мере модифицируется по структуре и химическому составу. У многих видов млекопитающих, например, по мере продвижения дробящихся зародышей по яйцеводу на прозрачной оболочке аккумулируется протеин, который образуется в яйцеводах под действием эстрогенов (Murray, Messinger, 1994; Hill et al., 1996; Buhi et al., 2000). При попадании эмбрионов в матку на zona pellucida адсорбируются белковые соединения (мукопротеиды), выделяемые маточными железами, при этом структура и характеристики прозрачной оболочки у многих, если не всех, млекопитающих изменяются (Denker, 2000). У некоторых видов млекопитающих по мере движения по репродуктивным путям появляются дополнительные оболочки, которые существуют наряду с zona pellucida, либо заменяют ее (Bet-teridge, 1989; Denker, 2000; Menkhorst, Selwood, 2008). Особенно хорошо они изучены у кролика и лошади (Boving, 1957; Betteridge, 1989; Denker, 2000). У кролика прозрачная оболочка постепенно замещается на сложную структуру, состоящую из нескольких слоев: неозона, мукопротеидный слой и глоиолемма (Boving, 1957; Denker, 2000). Этот процесс происходит постепенно и начинается на стадии ранней бластоцисты при переходе эмбриона в матку. Сначала на внешней поверхности zona pellucida образуется мукопротеидный слой, компоненты которого (мукопротеиды) продуцируются слизистой оболочкой матки. Постепенно прозрачная оболочка истончается и вместо
нее формируется внутренний слой — неозона. Ее ко
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.