ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИИ, 2011, том 58, № 6, с. 935-943
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОБРАБОТКА ГЕРБИЦИДОМ ГРАНСТАР ВЫЗЫВАЕТ ОКИСЛИТЕЛЬНЫЙ
СТРЕСС В ЛИСТЬЯХ ЗЛАКОВ
© 2011 г. А. Н. Гарькова, М. М. Русяева, О. В. Нуштаева, Ю. Н. Аросланкина, А. С. Лукаткин
ГОУВПО "Мордовский государственный университет им. Н. П. Огарёва", Саранск Поступила в редакцию 15.02.2011 г.
Высечки листьев и интактные 7-дневные растения озимой пшеницы (Triticum aestivum L., сорт Мироновская 808), озимой ржи (Secale cerale L., сорт Эстафета Татарстана), кукурузы (Zea mays L., гибрид Коллективный 172 МВ) и овсюга (Avena fatua L.) обрабатывали ксенобиотиком (гербицидом Гранстар, 3—300 мкг/л) и изучали эффекты кратковременного действия (до 3 ч) и длительного последействия (до 3 суток) на физиологические и биохимические параметры, связанные с развитием окислительного стресса. Выявлены изменения (преимущественно в сторону увеличения) интенсивности перекисного окисления липидов, генерации супероксидного анион-радикала (O2 ), общей антиоксидантной активности, активности защитных ферментов супероксиддисмутазы, ката-лазы и аскорбат-пероксидазы при действии гербицида. Реакции растений нелинейно зависели от концентрации гербицида и длительности его воздействия. Более устойчивыми оказались озимая пшеница и озимая рожь, менее устойчивыми — кукуруза и овсюг. Сделано заключение, что в основе ответных реакций клеток злаков на действие гербицида лежит возникновение окислительного стресса.
Ключевые слова: Triticum aestivum — Secale cerale — Zea mays — Avena fatua — ксенобиотики — окислительный стресс — активированные формы кислорода — перекисное окисление липидов — ферменты ан-тиоксидантной системы
ВВЕДЕНИЕ
Ксенобиотики — чужеродные соединения, индуцирующие в растениях разнообразные ответные реакции, приводящие к повреждению и гибели. Часто в основе первичных реакций растительной клетки на действие ряда ксенобиотиков лежит возникновение окислительного стресса — быстрая и временная продукция активированных форм кислорода (АФК) с максимумом, достигаемым за период от 15 мин до 2—3 ч [1]. В результате усиления генерации АФК в клетках растений изменяется баланс между образованием АФК и активностью системы антиоксидантной защиты в пользу первого [2]. Повреждение структуры мембран, усиление перекисного окисления липидов (ПОЛ), нарушение структуры белков и ДНК являются типичными последствиями возрастания АФК [3].
Сокращения: АОА — антиоксидантная активность, АПО — аскорбатпероксидаза, НСТ — нитросиний тетразолий, СОД — супероксиддисмутаза, DPPH — 1,1-дифенил-2-пик-рилгидразил.
Адрес для корреспонденции: Лукаткин Александр Степанович. 430005 Саранск, ул. Большевистская, 68. Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва, биологический факультет. Электронная почта: aslukatkin@yandex.ru
Гербициды представляют класс ксенобиотиков, которые обычно используются для управления ростом и воспроизведением нежелательной растительности. Это структурно неоднородная группа, оказывающая неблагоприятное действие после проникновения в растение. При выращивании растений на средах, содержащих высокие концентрации гербицидов, наблюдается подавление прорастания семян, замедление роста корня и побега, хлороз, нарушение физиологических функций [4]. Известен гербицид паракват (мети-лвиологен), который индуцирует в растениях окислительный стресс, ингибирует антиокси-дантную защиту и вызывает ультраструктурные изменения [5—10]. Показано, что обработка проростков кукурузы и бобов флуометуроном, атра-зином и римсульфуроном приводила к повышенному содержанию перекисей в клетках [3]. Имеются данные о влиянии глифосата на параметры окислительного стресса и активность антиокси-дантных ферментов [11, 12], о реакциях растений на стресс, вызванный гербицидами оксифлуор-феном [13], норфлуразоном [14], атразином [15]. Однако механизмы действия гербицидов, принадлежащих к различным группам, существенно разнятся, и неизвестно, все ли гербициды оказывают такие оксидативные эффекты на растения
[3]. Кроме того, действие гербицидов на разные виды растений весьма избирательно, поэтому сравнение ответных реакций целевых (сорных) и нецелевых (культурных) растений на обработку гербицидом позволит выяснить вклад систем ан-тиоксидантной защиты в механизмы избирательности.
В связи с этим, целью работы была оценка влияния ксенобиотиков на биохимические параметры, связанные с развитием окислительного стресса, на примере гербицида Гранстар (действующее вещество трибенуронметил). В задачи входило: (1) диагностика возникновения и определение интенсивности окислительного стресса в листьях четырех видов злаков при действии различных концентраций гербицида Гранстар, (2) выявление закономерностей развития реакций, входящих в комплекс противодействия окислительному стрессу, включая активность антиоксидантных ферментов и общую ан-тиоксидантную активность, в листьях при кратковременном (до 3 ч) и длительном (до 3 суток) действии гербицида.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований служили молодые растения кукурузы (Zea mays L.) гибрида Коллективный 172 МВ, озимой ржи (Secale cerale L.) сорта Эстафета Татарстана, озимой пшеницы (Triti-cum aestivum L.) сорта Мироновская 808 и овсюга (Avena fatua L.). Для моделирования стрессового воздействия использовали различные концентрации гербицида Гранстар (производитель — "DuPont", США). Гранстар — послевсходовый гербицид системного действия, действующим веществом является трибенуронметил (класс сульфонилмочеви-ны). Попадая в растение через листья или через корни, он проникает в апикальные меристемы корня или побега и через 2—3 ч блокирует деление клеток чувствительных видов, ингибируя ацето-лактаткиназу, которая катализирует образование аминокислот с разветвленной цепью (валина и изолейцина).
Постановка эксперимента. Семена злаков высаживали в сосуды с почвой (среднесуглинистый выщелоченный чернозем) и выращивали растения в лабораторных условиях до фазы 2—3 листьев (возраст 7 суток) при температуре 22—25°С, освещении люминесцентными лампами с плотностью потока фотонов около 200 мкмоль/(м2 с), влажности воздуха около 80%, продолжительности светового дня 12 ч. Полив производили через день. В первой серии опытов высечки листьев 7-дневных растений в течение 1—3 ч выдерживали в растворах гербицида Гранстар (3, 30 и 300 мкг/л),
после чего определяли генерацию O2-, активность супероксиддисмутазы (СОД), каталазы и аскорбатпероксидазы (АПО). В качестве контро-
ля использовали высечки, выдержанные в дистиллированной воде.
Во второй серии опытов 7-дневные растения опрыскивали растворами гербицида Гранстар (3, 30 и 300 мкг/л) из расчета 2 мл/растение (контрольные растения обрабатывали водой). Спустя 1, 2 и 3 суток в растениях определяли генерацию
02-, интенсивность ПОЛ, активность СОД и общую антиоксидантную активность.
Скорость генерации супероксидного анион-радикала определяли по способности О^ окислять адреналин в адренохром по методике, подробно описанной в [16]. Скорость генерации О^ рассчитывали по молярной экстинкции (б = 4020 (М см)-1) и выражали в мкмоль/(г сырой массы мин).
Интенсивность ПОЛ определяли по накоплению малонового диальдегида (МДА) по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой [16]. Количество МДА в листьях рассчитывали в мкмоль/г сырой массы по молярной экстинкции (б = 1.56 х х 105 (М см)-1).
Активность СОД (КФ 1.15.1.1) определяли в цитозольной фракции (полученной после центрифугирования гомогената 15 мин при 7000 g) методом, основанным на восстановлении нитро-синего тетразолия (НСТ) супероксидным радикалом с образованием голубых формазанов НСТ [17]. Расчет проводили в ед. акт./г сырой массы. За единицу активности СОД принимали 50%-ное ингибирование образования формазана.
Активность каталазы (КФ 1.11.1.6) определяли по снижению оптической плотности (при разложении Н2О2) при 240 нм по методике [17]. Активность рассчитывали в мкмоль Н2О2/(г сырой массы мин) с использованием коэффициента молярной экстинкции б = 39.4 (мМ см)-1.
Активность АПО (КФ 1.11.1.11) определяли по окислению аскорбата по методике [17], рассчитывали по молярной экстинкции (б = 2.8 (мМ см)-1) и выражали в мкмоль аскорбата/(г сырой массы мин).
Общую антиоксидантную активность (АОА) определяли по методике, основанной на ингиби-ровании радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидра-зила ^РРН). Навеску листьев (1 г) измельчали, готовили этанольную вытяжку объемом 10 мл, центрифугировали 15 мин при 1500 g. К 2 мл на-досадочной жидкости добавляли 1 мл DPPH (200 мкМ в 50% этаноле) и сразу измеряли оптическую плотность при длине волны 517 нм против 50% этилового спирта. Затем инкубировали 30 мин на свету и повторно измеряли оптическую плотность с последующим расчетом ингибирова-ния DPPH (в %):
ингибирование DPPH = [(ДС(0) - Д^УД^о)] х 100%,
где Д.(о) — оптическая плотность до инкубации на свету, Лщ — оптическая плотность после 30 мин светового инкубирования в реакционной смеси [18].
Статистическая обработка результатов. Все
определения проводили в 3 независимых опытах, состоявших из 2—3 биологических повторностей (отдельных растений), каждый вариант включал 3 аналитические повторности. Результаты обрабатывали статистически по общепринятым биометрическим формулам с использованием пакетов прикладных программ "Microsoft Excel". В таблицах и на рисунках представлены средние значения из всех опытов с их стандартными ошибками, рассчитанными по стандартным биометрическим критериям. Достоверность различий между вариантами опыта оценивали по ¿-критерию Стьюдента при уровне значимости 0.05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Краткосрочное действие гербицида Гранстар
на генерацию O- в высечках листьев злаков
При инкубировании высечек листьев в растворах гербицида Гранстар обнаружено, что скорость
генерации O2- у растений всех видов злаков возрастала почти линейно с повышением концентрации и длительности выдерживания (рис. 1). У пшеницы выявлено значительное превышение контроля (на 20—25%) уже при инкубировании в растворах 3 и 30 мкг/л, а при максимальной концентрации препарата 300 мкг/л уровень АФК резко увеличился
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.