ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 534-541
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОБРАБОТКА ГЛИЦИНБЕТАИНОМ СНИЖАЕТ ВРЕДНОЕ ВЛИЯНИЕ ЗАСУХИ НА РАСТЕНИЯ ТАБАКА
© 2007 г. С. Л. Ма, Я. Ц. Ван, С. Л. Си, Ч. Ван, В. Ван
Колледж естественных наук и колледж защиты растений, Шаньдунский сельскохозяйственный университет,
Тайюань, Китай Поступила в редакцию 24.08.2006 г.
Мы сравнили влияние обработки 80 мМ глицинбетаином (ГБ) листьев двух сортов табака (МсоШпа шЬасит L.), различающихся по засухоустойчивости, в условиях достаточного увлажнения и недостатка воды. Засуха влияла на вес и высоту растений; подавление роста было сильнее у чувствительного к засухе сорта. Опрыскивание листьев ГБ, который адсорбировался и накапливался в листьях, стимулировало рост растений, подвергнутых засухе. Обработанные ГБ растения сохраняли воду в листьях очевидно благодаря поддержанию осмотического давления. Обработка ГБ активировала фотосинтез при засухе, главным образом, благодаря повышенной проводимости устьиц и эффективности карбоксилирования при ассимиляции С02. Обработка ГБ повышала эффективность работы ФС II (ФPSП). ГБ также активировал ферменты антиоксидантной защиты в условиях засухи. Все эти процессы приводили к увеличению веса и высоты растений. Итак, обработка листьев ГБ на стадии быстрого роста растений приводила к улучшению водного баланса растений и активации ФС II в условиях засухи.
МсоНапа ШЬасит - ферменты антиоксидантной защиты - фотосинтез - содержание ионов - активные формы кислорода - недостаток воды
ВВЕДЕНИЕ
Табак - это засухоустойчивое растение, но оно может быть довольно чувствительным к недостатку воды в период быстрого роста и растяжения листьев. Засуха подавляет рост табака, приводя к уменьшению высоты растений и площади листьев, особенно в период быстрого роста [1]. Поэтому необходимо разработать стратегию повышения засухоустойчивости растений табака.
Глицинбетаин (№, N №'-триметилглицин, ГБ) -четвертичное соединение аммония, накапливающееся в самых разных организмах, обитающих в засушливых и засоленных районах. ГБ не токсичен для клетки; он снижает осмотический потенциал внутри клеток, подвергнутых гипертоническому стрессу [2, 3]. Более того, ГБ более эффективен, чем другие совместимые осмолиты, в
Сокращения: АПО - аскорбатпероксидаза; АФК - активные формы кислорода; ГБ - глицинбетаин; КАТ - каталаза; МДА - малоновый диальдегид; ОСВ - относительное содержание воды; СОД - супероксиддисмутаза; C; - концентрация CO2 в межклетниках; Gs - устьичная проводимость; Pn -видимый фотосинтез; ФPSII - эффективный квантовый выход ФС II.
Адрес для корреспонденции: W. Wang. College of life science and College of plant protection, Key laboratory of crop biology of Shandong, Shandong agricultural university, Tai'an, Shandong, 271018, China. E-mail: wangw@sdau.edu.cn
поддержании целостности мембран, защите ферментов и функциональных комплексов (например, кислород-выделяющий комплекс ФС II и Ру-биско) [4-6]. Защитная роль ГБ при разных стрессах побудила многих исследователей к измерению его содержания в растениях. Получен ряд трансгенных растений, особенно тех, которые не накапливают ГБ в естественных условиях. К ним относится и табак, сорта которого различаются по накоплению ГБ и устойчивости к стрессам [5, 7, 8]. Однако в большинстве случаев содержание ГБ в таких растениях было много ниже, чем в естественных аккумуляторах ГБ из-за ряда факторов и, в частности, из-за низкого содержания холина, предшественника ГБ [9, 10]. Мы попытались повысить содержание ГБ в растениях табака для повышения их устойчивости к стрессу, обрабатывая растения экзогенным ГБ.
В данной работе мы обрабатывали ГБ листья двух сортов табака, различающихся по засухоустойчивости, и исследовали влияние этой обработки на рост растений. В работе обсуждаются возможные физиологические механизмы проявления защитной функции ГБ.
МЕТОДИКА
Приобретение и обработка растений табака.
Семена двух сортов табака (ШсоНапа tabacum Ь.),
засухоустойчивого сорта DHJ5210 и чувствительного к засухе сорта ZY100, были получены на кафедре изучения табака Шаньдунского сельскохозяйственного университета (Китай). Их проращивали в пластмассовых кюветах в почве, смешанной с органическими удобрениями. После появления 4-го листа проростки высаживали в горшки диаметром 15 см и высотой 20 см, заполненные 1.5 кг смеси почвы и органических удобрений. В них растения росли до достижения стадии быстрого роста.
Прежде чем создать условия засухи, листья обильно опрыскивали Твин-20 (контроль) или 80 мМ ГБ в растворе, содержавшем 0.2%-ный Твин-20. Опрыскивание проводили в течение трех дней дважды в день (в 6:00 и 18:00).
После обработки часть контрольных и экспериментальных растений подвергали засухе, ограничивая их полив. В течение 15 дней влажность почвы поддерживали на уровне 50% от ее полного насыщения. Остальные растения поливали, как обычно. Итак, анализировали 4 группы растений:
(1) контрольные растения, нормальный полив;
(2) контрольные растения, режим засухи; (3) растения, обработанные ГБ, нормальный полив и (4) растения, обработанные ГБ, режим засухи.
Оценка устойчивости к засухе. Листья одинакового яруса отделяли от растений и определяли в них содержание ГБ, используя модифицированную процедуру ВЭЖХ (Shimadzu-LC-6A, "Shimad-zu Corp.", Япония), исходно описанную Gorham с соавт. [11]. Образцы листьев растирали в 2 мл смеси метанола, хлороформа и 0.2 мМ KHCO3 (12 : 5 : 1) и споласкивали ступку дважды той же смесью. Гомогенат инкубировали при 60°C при встряхивании в течение 20 мин и центрифугировали 10 мин при 10000 g при 4°C. Осадок экстрагировали той же смесью, а затем смесью метанола и воды (1 : 1). Супернатант собирали и смешивали с 2 мл хлороформа и 4 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивали и центрифугировали 10 мин при 10000 g при 4°C. Затем пропускали верхнюю водную фазу через колонки ион-обменных смол, Amberlite CG250 cation (1 мл) и Dowex1-X2 anion (2 мл). Колонки промывали 3 мл дистиллированной воды и 4 мл 4 мМ NH4OH. Элюат высушивали, растворяли в 2 мл метанола, фильтровали через мембранный фильтр с порами 0.25 мкм и вводили в систему для ВЭЖХ. Для хроматографии использовали колонку (4.6 х 250 мм), упакованную Hypersil SCX (10 мкм). В качестве подвижной фазы применяли 0.2 мМ NH4H2PO4 в 50%-ном метаноле. Концентрацию ГБ определяли на УФ-детекторе при 195 нм путем сравнения площади полученного пика с пиком стандартного ГБ ("Sigma", США).
Параметры газообмена (включая Pn, Ci и Gs) измеряли с помощью переносного дифференци-
ального CO2/H2O инфракрасного газоанализатора ("PP Systems", Великобритания). Воздух очищали от CO2 и смешивали его с чистой CO2 до концентрации 360 мг/л. Температуру внутри листовой камеры повышали до 28°С. Затем измеряли эффективный квантовый выход ФС II ^PSll) в листьях после адаптации к освещению 800 мкмол/(м2 с) в течение 30 мин, используя переносной FMS-2 фазо-во-модуляционный флуорометр ("Hansatech Instruments", Великобритания). ФPSП в листьях после адаптации к освещению, т.е. квантовый выход начинающихся фотохимических реакций в ФС II, тесно связанный с квантовым выходом при нециклическом транспорте электронов, определяли по Genty с соавт. [12], используя формулу ФPSП =
= Fm — FJ Fm .
Устьичную проводимость (Gs) измеряли с помощью того же самого инфракрасного газоанализатора и выражали в ммолях H2O, рассеянной с 1 м2 поверхности листа за 1 с.
Относительное содержание воды (ОСВ) подсчитывали по формуле (FW - DW)/(SFW - DW) х 100%, где FW - сырой вес, SFW - сырой вес при насыщении ткани водой и DW - сухой вес после высушивания образцов при 80°С в течение 24 ч.
Для измерения содержания суммы хлорофил-лов a + b из листьев одного яруса трех растений выбивали диски, немедленно замораживали их в жидком азоте и хранили при -70°С. Замороженные диски растирали при рассеянном свете в ступке с жидким азотом. Пигменты экстрагировали 4 мл ледяного 100%-ного метанола, и экстракт центрифугировали на холоду (4°С) при 3000 об./мин в течение 10 мин. Содержание хлорофилла измеряли на UV-160A спектрофотометре ("Shimadzu") при 665.2 и 652.4 нм и рассчитывали, как описано Lichtenthaler [13]. Пролин определяли спектрофо-тометрически с нингидрином, как описано Bates с соавт. [14]. Растворимые сахара определяли спек-трофотометрически с антроном, как описано Trevelyan с соавт. [15]. Перекисное окисление ли-пидов оценивали по содержанию его продукта -малонового диальдегида (МДА), как описано ранее [16].
Содержание ионов определяли следующим образом: образцы листьев сушили в печи при 105°С в течение 15 мин, а затем при 80°С до постоянного веса. Примерно 150 мг сухих листьев озоляли в печи при 550°С. Золу растворяли в 75%-ной HNO3 и разбавляли дистиллированной водой до 100 мл. Концентрации K+, Na+ и Cl- в растворе HNO3 определяли с помощью абсорбционного спектрофотометра Hitachi Z-8000 ("Hitachi", Япония) и пересчитывали в процентах к сухому весу.
Активности супероксиддисмутазы (СОД), ка-талазы (КАТ) и аскорбатпероксидазы (АПО) определяли, как описано Prochazkova с соавт. [16].
л
4 о
5 M Я « <о
я
р
1-4
«
5
к
се *
6
о и о О
1200 1000 800 600 400 200
2 4
1
DHJ5210 ZY100
Рис. 1. Влияние обработки ГБ и засухи на содержание ГБ в листьях табака засухоустойчивого DHJ5210 и чувствительного к засухе ZY100 сортов. 1 - контрольные листья, нормальный полив; 2 - обработка ГБ, нормальный полив; 3 - контрольные листья, засуха; 4 - обработка ГБ, засуха. Представлены средние значения из 5 повторностей и их стандартные ошибки.
Образцы листьев (1 г) растирали в ступке с 8 мл 0.05 M Na2HPO4/NaH2PO4-6yùepa (pH 7.8), содержавшего 1 M ЭДТА-№2. Гомогенаты фильтровали через 4 слоя газа и центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин при 4°C. Супернатанты собирали и определяли в них активности ферментов антиоксидантной защиты при 4°C.
Все измерения повторяли, по крайней мере, три раза, и результаты были подвергнуты статистическому анализу, используя стандартную версию программы SAS 9.0. Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью тест
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.