научная статья по теме ОБРАТНО-ФАЗОВАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ СТАБИЛЬНЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ Сельское и лесное хозяйство

Текст научной статьи на тему «ОБРАТНО-ФАЗОВАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ СТАБИЛЬНЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ»

ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 2, с. 166-174

= ХИМИЯ ПОЧВ =

УДК 631.4

ОБРАТНО-ФАЗОВАЯ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ СТАБИЛЬНЫХ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ ФРАКЦИЙ ПОЧВЕННЫХ ГУМИНОВЫХ КИСЛОТ*

© 2015 г. О. А. Трубецкой1, О. Е. Трубецкая2

1Институт фундаментальных проблем биологии РАН, 142290, Пущино Московской обл., ул. Институтская, 2

e-mail: olegi03@yahoo.com

2Филиал Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, 142290,

Пущино Московской обл., ул. Институтская, 8 e-mail: trub@bibch.ru Поступила в редакцию 10.02.2014 г.

Обратно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ) использовали для анализа гидрофобности почвенных гуминовых кислот и их стабильных электрофоретических фракций А, В и C + D, предварительно полученных сочетанием эксклюзивной хроматографии на сефадексе с электрофорезом в полиакриламидном геле. В двух гуминовых кислотах различного генезиса электрофоретическая фракция А наибольшего молекулярного размера оказалась самой гидрофобной (60—73% фракции необратимо адсорбировалось на гидрофобной ОФ-колонке С18), а фракция C + D наименьшего молекулярного размера — наиболее гидрофильной. Фракция В среднего размера занимала промежуточное положение по степени гидрофобности (33—47% фракции необратимо адсорбировалось на колонке). Использование ОФ-ВЭЖХ впервые позволило детектировать в составе почвенных гуминовых кислот гидрофобную электрофоретическую фракцию А наибольшего молекулярного размера, состоящую главным образом из алифатических длинноцепо-чечных углеводородных, белковых и углеводных фрагментов. Информация о степени гидрофобности в сочетании с ранее полученным набором физико-химических характеристик стабильных элек-трофоретических фракций обсуждается в свете супрамолекулярной и макромолекулярной концепций строения почвенных гуминовых кислот.

Ключевые слова: гуминовые вещества, гидрофобность/гидрофильность, супрамолекулярное или макромолекулярное строение.

DOI: 10.7868/S0032180X15020124

Гуминовые вещества (ГВ) почв, традиционно разделяемые на гуминовые кислоты (ГК), фульво-кислоты (ФК) и гумин, составляют значительную часть биосферного органического углерода, на порядок превышая его суммарное содержание в живых организмах планеты. Несмотря на более чем двухсотлетнюю историю изучения, представления о молекулярной структуре ГВ крайне противоречивы. Многочисленные предложенные формулы строения основаны на теоретических предположениях или единичных экспериментах. Оказывая существенное влияние на физико-химические свойства почвы (емкость поглощения, устойчивость агрегатов почвенных частиц, водоудерживающие свойства и т. д.), ГВ выполняют ряд важнейших функций, таких как стимуляция роста растений, связывание металлов, деградация и транспорт органических поллютантов и т. д. Степень гидрофоб-ности является одним из важнейших свойств,

* Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 13-05-00241а

определяющих многочисленные функции почвенных ГВ, и весьма существенна для выяснения фундаментальной природы химических взаимодействий на молекулярном уровне между почвенной минеральной матрицей и ее органическим компонентом. Кроме того, информация о гидрофобности ГВ имеет важное экологическое значение при прогнозе стабильности агрегатов почвенных частиц и их водоудерживающей способности.

Фракционирование на основе различий в гид-рофобности/гидрофильности является стандартной процедурой при изучении сложной природной полидисперсной смеси, каковую представляют собой ГВ. В последние 30 лет для анализа исходных препаратов ГК и ФК различного происхождения используют как гидрофобную хроматографию низкого давления [2, 3, 14], так и обратно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию (ОФ-ВЭЖХ) [24, 26, 36, 41, 44, 53, 54].

Природные ГВ являются полиэлектролитами, поэтому для их фракционирования на основе раз-

личий в электрофоретической подвижности в последние 40 лет широко применяется метод электрофореза. Среди множества видов метода наиболее эффективным в настоящее время является электрофорез в полиакриламидном геле (ЭПАГ) [7, 16-18, 23, 27, 45, 47-49]. Однако исследования ГВ с использованием ЭПАГ в основном ограничивались либо приблизительной сравнительной оценкой молекулярных размеров полученных электрофоретических фракций, либо сводились к фингерпринтовой (отпечатковой) характеристике исследуемых препаратов, что не снижает ценности полученных результатов.

Ранее [45] разработан эффективный метод фракционирования ГВ, основанный на сочетании препаративной эксклюзивной хроматографии (ЭХ) на колонке с сефадексом G-75 с аналитическим ЭПАГ в 10%-ном полиакриламидном геле. Собственно фракционирование ГВ осуществляют с помощь ЭХ, затем хроматографиче-ский профиль тестируют ЭПАГ, на основе которого ведут отбор индивидуальных стабильных электрофоретических фракций. Новизна и преимущество данного сочетания ЭХ-ЭПАГ состоит в том, что 7М раствор мочевины, используемый в ЭХ и ЭПАГ, разрывает водородные связи, предотвращая как взаимодействие между отдельными компонентами ГВ, так и между ГВ и твердой неподвижной фазой, на которой осуществляют фракционирование. Кроме того, мочевина является дезагрегирующим агентом, взаимодействуя с гидрофобной неполярной частью насыщенных углеводородных цепей [21].

Сочетание ЭХ-ЭПАГ впервые позволило получить из почвенных ГВ различного генезиса препаративные количества фракций, существенно различающихся по молекулярному размеру (МР) и электрофоретической подвижности, оптическим свойствам, весовому содержанию белковых, углеводородных и углеводных фрагментов, ароматичности, фотохимической активности и флуоресцентным свойствам [9, 11, 33, 35, 46, 48, 49].

Цели работы: 1) проведение ОФ-ВЭЖХ для анализа гидрофобности почвенных ГК различного генезиса и их стабильных электрофорети-ческих фракций, предварительно полученных сочетанием ЭХ-ЭПАГ; 2) выявление взаимосвязи между степенью гидрофобности и другими свойствами ГК и их электрофоретических фракций (генезисом и географическим положением почвы, молекулярными размерами фракций, оптической плотностью и ароматичностью, содержанием белковых, углеводных и углеводородных фрагментов); 3) продолжение дискуссии о су-прамолекулярной и макромолекулярной концепциях строения почвенных ГК, развернутой в журнале "Почвоведение" [12-13].

В качестве объектов исследования использовали ГК чернозема типичного, являющегося одной из самых плодородных и наиболее зрелых почв России, и стандарт почвенных ГК 1S102H Международного общества гуминовых веществ.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

Образец почвы взят из гор. А чернозема типичного тяжелосуглинистого на лёссе (Курская обл.). Гуминовые вещества экстрагировали один раз раствором 0.1 М пирофосфата натрия и 0.1 М NaOH (рН ~ 13), ГК получали кислотным осаждением по методике, опубликованной ранее [49]. Содержание углерода, водорода и азота в препаратах ГК проводили на CHNS/O-анализаторе серии II 2400 (Perkin Elmer, США), а зольность и влажность препаратов — на термальном анализаторе (Perkin Elmer, США). Элементный состав ГК в массовых процентах (в расчете на сухое беззольное вещество): С - 62.5, Н - 4.3, N - 4.2.

В качестве сравнительной почвенной ГК использовали стандарт Международного общества гуминовых веществ 1S102H, выделенный из почвы Эллиот (Elliott soil), шт. Иллионойс, США. Элементный состав ГК в массовых процентах (в расчете на сухое беззольное вещество): С — 58.1, Н — 3.7, N — 4.1 (более подробную информацию можно найти в Интернете на сайте www.ihss.gatech.edu).

Сочетание препаративной эксклюзивной хроматографии на колонке с сефадексом G-75 в 7М растворе мочевины с аналитическим электрофорезом в 10%-ном полиакриламидном геле использовали для получения стабильных электро-форетических фракций ГК по ранее описанной методике [45]. Из обоих препаратов ГК получили по три фракции А, В и C + D, различающихся по МР и электрофоретической подвижности.

Аналитическую обратно-фазовую высокоэффективную жидкостную хроматографию образцов ГК и фракций проводили на приборе "Waters ACQUITY™ Ultra-Performance Liquid Chromatographic system" фирмы Waters (США) на колонке UPLC© BEH C18 размером 2.1 x 100 мм (Waters, США) с привитыми линейными алкильными насыщенными углеводородными цепями С18Н37. Скорость элюции составляла 0.3 мл/мин. Несомненным преимуществом ОФ-ВЭЖХ последнего поколения является возможность анализировать микрограммы ГВ.

Раствор А (100% метанол) и раствор В (10 мМ фосфатный буфер, рН 6.5) использовали для формирования ступенчатого градиента На рис. 1 представлен график ступенчатого градиента метанола, использованного в данной работе. По мере увеличения концентрации метанола увеличивалась гид-рофобность подвижной фазы, что позволяло смывать с ОФ-колонки С18 все более и более гид-

Время элюции, мин

Рис. 1. Форма ступенчатого градиента метанола, использованного для фракционирования препаратов ГК и фракций с помощью ОФ-ВЭЖХ. Метанол смешивали с 10 мМ фосфатным буфером, рН 6.5.

1 2

А

B

C + D

Рис. 2. Электрофорез ГК чернозема (1) и международного почвенного стандарта ГК 1S102H (2) в 10% ПАГ. Естественно окрашенные коричневые зоны на электрофореграмме представляют собой фракции А, В и C + D.

рофобные компоненты исследуемого вещества. При этом следует иметь в виду, что наиболее гидрофобные компоненты анализируемой смеси веществ могут необратимо адсорбироваться на колонке.

Оценку гидрофобности фракций ГК проводили на основании подсчета общей площади каждой хроматограммы и ее отдельных пиков с использованием программы Empower2TM (Waters, США). Для проведения сравнения степени гид-рофобности фракций на колонку наносили оди-

наковое количество (0.005 мл) каждого образца. Оптическая плотность при 270 нм растворов ГКчернозема и их фракций составляла 3.2 оптические единицы, а для международного почвенного стандарта ГК и его фракций — 10.2 оптических единиц. Регистрацию хроматографических профилей для сравнения гидрофобности образцов осуществляли при длине волны 270 нм с помощью фотодиодного детектора (Waters, США).

Спектры поглощения ГК и фракций измеряли в диапазоне 210—

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Сельское и лесное хозяйство»