ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 46, № 1, с. 51-57
УДК 579.873:631.811.98
ОБРАЗОВАНИЕ АУКСИНОВ ЭНДОФИТНЫМИ АКТИНОБАКТЕРИЯМИ
ОЗИМОЙ РЖИ
© 2010 г. О. В. Мерзаева, И. Г. Широких
Зональный НИИ сельского хозяйства Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого РАСХН, Киров, 610007
e-mail: irgenal@mail.ru Поступила в редакцию 24.07.2008 г.
Исследована способность актиномицетов и коринеформных бактерий, изолированных из корневых тканей озимой ржи, к образованию ауксинов в жидкофазной культуре. Изоляты коринеформных бактерий продуцировали в среду индолил-3-уксусную кислоту (ИУК) в количестве от 9.0 до 95.0 мкг/мл, изоляты актиномицетов — от 39.5 до 83.0 мкг/мл. Максимальное накопление ИУК в культуральной жидкости актинобактерий в основном совпадало с наступлением стационарной фазы роста культур. Выявлена зависимость образования ИУК актинобактериями от состава и кислотности питательной среды, концентрации в ней триптофана, условий аэрации. Проведена оценка биологической активности бактериальной ИУК. Обработка семян озимой ржи коринеформными ауксинпродуцирующими бактериями способствовала повышению всхожести и более интенсивному росту проростков in vitro.
Синтез ауксинов рассматривается сегодня, как важное условие для ассоциативного взаимодействия ризобактерий с растениями [1]. Ауксины управляют процессами вегетативного роста, цветения и плодоношения растений, а также влияют на фотосинтез, образование пигментов, биосинтез различных метаболитов и устойчивость растений к стрессовым факторам среды [2]. Получены данные об участии ауксинов в регуляции экспрессии генов растений [3]. Микроорганизмам экскреция фито-гормонов часто помогает занять определенную экологическую нишу. Универсальные симбионты высших растений — ростстимулирующие ризобактерии (РСРБ) (plant growth-promoting rhizobacteria) — обладают комплексом положительных свойств, включающим, как правило, синтез ауксинов [4—7].
Одним из широко распространенных в природе фитогормонов, наиболее активным в группе ауксинов, является индолил-3-уксусная кислота (ИУК). К образованию ИУК способны многочисленные микроорганизмы, которые могут изменять содержание данного ауксина в разных тканях и органах растения. Синтез ИУК обнаружен как у представителей фитопатогенной микрофлоры [8], так и у эпифитных [9—12] бактерий многих семейств (Azotobacteriaceae, Bacillaceae, Enterobacte-riaceae, Pseudomonadaceae и других). Выявлены некоторые экзогенные факторы, оказывающие влияние на образование ауксинов отдельными группами бактерий, участвующих в ассоциациях с растениями. Основным условием синтеза ИУК ризосферными бактериями является наличие в корневых экссудатах триптофана — предшествен-
ника ИУК [13]. Однако у некоторых бактерий (азо-спириллы и цианобактерии) обнаружен независимый от этой аминокислоты путь биосинтеза [14]. Определенное влияние на интенсивность образования бактериями ИУК при жидкофазном культивировании оказывает аэрация среды [11]. Синтез ауксина зависит также от источника азота в среде: в культурах псевдомонад [12] и метилотрофных бактерий [9] образование ИУК ингибировалось ионами аммония.
За пределами пристального внимания исследователей оставалась до последнего времени способность к синтезу ИУК представителей класса Acti-nobacteria, которые также постоянно встречаются в фитосфере [15—17] и могут участвовать в фито-гормональной регуляции роста растений [18, 19]. В литературе имеются лишь отдельные упоминания о способности представителей родов Streptomyces [18—20], Micromonospora, Corynebacterium, Frankia, Mycobacterium [18], Rhodococcus, Curtobacterium [21] к синтезу ауксинов. Остаются невыясненными условия, которые способствуют образованию ИУК актинобактериями.
Цель работы — изучение способности к синтезу ИУК среди эндофитных актиномицетов и корине-формных бактерий озимой ржи, а также выяснение необходимых для этого условий.
МЕТОДИКА
В работе использовали бактерии, предварительно изолированные нами из корневых тканей озимой ржи сорта Вятка 2. Очищенные и разрезан-
51
4*
52
МЕРЗАЕВА, ШИРОКИХ
ные на сегменты (10 мм) корни стерилизовали в течение 15 мин смесью 3%-ного пероксида водорода и 96%-ного этилового спирта (1 : 1). Затем корни в течение 15 мин трижды отмывали в стерильной дистиллированной воде, гомогенизировали их в ступке, делали разведения и высевали на агаризованную среду с пропионатом натрия [22]. В ходе работы было получено 30 культур актинобак-терий, в том числе 14 актиномицетов и 16 корине-форм. Изучение морфологических, культуральных и физиолого-биохимических признаков для определения таксономической принадлежности изоля-тов проводили в соответствии с определителями [23, 24]. Для родового определения актиномицетов были использованы среды Гаузе 1 и овсяный агар [24]. Учитывали следующие характеристики: наличие фрагментации мицелия, расположение и число спор на воздушном и(или) субстратном мицелии, наличие спорангиев, подвижность спор.
Для идентификации бактериальных культур, помимо микроскопирования, проводили следующие тесты: на наличие оксидазы, каталазы, окислительно-ферментативный тест на использование глюкозы, определение амилолитической, протео-литической и целлюлозолитической активности, тест на способность к спорообразованию. Более глубокое изучение хемотаксономических признаков на этом этапе нами не проводилось.
Подбор условий и продолжительности культивирования, обеспечивающих максимальный выход ауксинов в культуральную жидкость, проводили индивидуально для ряда актиномицетов (Strep-tomyces sp. 3s, Streptomyces sp. s, Micromonospora sp. 2M-I) и коринеформных бактерий — Curtobacterium plantarum 6-I, C. plantarum 2-II, Cellulomonas sp. 7. Для сравнительной оценки результатов использовали бактерии, не относящиеся к актиномицетной линии и известные из литературы, как активные продуценты ауксинов: Pseudomonas fluorescens 540 (из коллекции 48 ЦНИИ Минобороны России, г. Киров) [6, 12], Agrobacterium radiobacter 10 [4, 11] и Flavobacterium sp. L30 (из коллекции ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии РАСХН, г. Пушкин) [4].
Бактерии выращивали в колбах объемом 250 мл со 100 мл жидкой среды, содержащей (г/л): глюкоза — 2.0, сахароза — 2.0, пептон — 1.0, дрожжевой экстракт - 1.0, К2НРО4 - 0.5, NaCl - 0.1, MgSO4 -0.2, (NH4)2SO4 - 0.5, CaCl2 - 0.02, FeCl3 - 0.01, Na2MoO4 - 0.002; pH 6.8-7.2. Руководствуясь данными литературы, что ионы аммония могут инги-бировать синтез ауксинов, осуществляли выращивание бактерий также на среде, в которой источник азота был представлен нитратной формой (0.75 г/л KNO3).
При исследовании влияния триптофана на синтез ИУК в среду добавляли DL-триптофан ("ДИА-
ЭМ", США) в количестве 50, 200 и 400 мкг/мл. Исследовали также способность актинобактерий к синтезу ауксинов при разных значениях кислотности среды (рН 5.5, 7.0 и 9.0). Для изучения влияния на синтез ИУК дополнительной аэрации актино-бактерии выращивали стационарно и на качалке (180 об/мин).
Определение количества ИУК проводили с использованием реактива Сальковского на фото-электроколориметре (ФЭК 56М, Россия) при длине волны 540 нм. Для построения калибровочного графика использовали разведения стандартного раствора ИУК ("Fluca", Швейцария). Контролем служила неинокулированная среда с добавлением реактива. Культуральную жидкость от клеток микроорганизмов освобождали центрифугированием при 6000 g в течение 10 мин. Биомассу бактерий определяли гравиметрически после фильтрования жидкой культуры через мембранный фильтр ("Millipore", США).
Для изучения биологической активности ИУК использовали инокуляцию семян озимой ржи (Secale cereale L.) сорта Вятка 2 изолятами коринеформных бактерий и штаммом P. fluorescens 540. Семена предварительно стерилизовали смесью 3%-ного пероксида водорода и 96%-ного этилового спирта (1:1) и проращивали в течение 2 сут на голодном агаре, а затем помещали в высокие стеклянные пробирки, наполненные дерново-подзолистой почвой (дробная стерилизация автоклави-рованием при 1.2 атм, 30 мин), увлажненной до 60% от полной влагоемкости. В почву одновременно с семенами вносили по 1.5 мл бактериальных суспензий, что обеспечило исходную концентрацию клеток в 1 г почвы C. plantarum 2-II — 8 х 108; Cellulomonas sp. 7—3 х 109; C. plantarum 6-I — 1 х 1010; P. fluorescens 540—2 х 107. Каждой культурой иноку-лировали не менее 18 семян. Бактерии для инокуляции выращивали на качалке при комнатной температуре на среде выше приведенного состава с нитратным источником азота.
Инокулированные растения выращивали в камере искусственного климата ILKA (Германия) при 25/18°С (день/ночь) и фотопериоде 16 ч. Для тестирования растений на наличие в тканях бактерий-инокулятов выполняли посев из разведений гомо-генатов тканей на плотную питательную среду на 4, 14 и 24 сут эксперимента. Ответную реакцию растений на инокуляцию культурами бактерий оценивали по изменению длины корня, высоты побега, сухой биомассе. Биометрические параметры определяли на 24 сут эксперимента. Контролем служили неинокулированные растения.
Статистическая обработка данных проведена стандартными методами [25] с использованием программ EXCEL и STATGRAFICS.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Среди изолятов из поверхностно стерилизованных корневых тканей озимой ржи способностью к синтезу ИУК обладали 12 культур (75%) корине-формных бактерий и 10 культур (71%) актиноми-цетов. По накоплению ИУК в культуральной жидкости эндофитные актинобактерии не уступали, а в ряде случаев и превосходили представителей группы РСРБ-бактерий, ассоциированных с корнями растений и оказывающих на растения стимулирующее их рост влияние. Так, 7 изолятов по количеству образуемых ауксинов превосходили штаммы типичных ризосферных бактерий Р. Аиогвзсвт 540 (58 мкг/мл) и Р!ауоЬас1впит 8р. L30 (65 мкг/мл). Среди эндофитных изолятов встречались корине-бактерии, синтезирующие ИУК 94—95 мкг/мл, а также актиномицеты, у которых выход ИУК составлял 77—83 мкг/мл.
Сопоставление динамики бактериальной биомассы и концентрации ИУК в культуральной жидкости показало, что максимум накопления ауксинов у большинства из исследованных куль
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.