УДК 577.27
ОБРАЗОВАНИЕ КОМПАКТНЫХ СКОПЛЕНИЙ
В-ЛИМФОЦИТОВ В ЛЕГОЧНОЙ ТКАНИ ПРИ МИКОБАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНФЕКЦИЯХ У МЫШЕЙ ЗАВИСИТ ОТ ПРОДУКЦИИ ЭТИМИ КЛЕТКАМИ TNF И НЕ ЯВЛЯЕТСЯ ФАКТОРОМ ИММУНОЛОГИЧЕСКОЙ ЗАЩИТЫ ХОЗЯИНА
© 2014 Т.К. Кондратьева1, И.А. Линге1, Е.В. Кондратьева1, А.В. Дятлов1,2, М.С. Друцкая2,3, Р.В. Зварцев3, С.А. Недоспасов2,3, А.С. Апт1,2*
1 Центральный научно-исследовательский институт туберкулеза РАМН, 107564 Москва, Яузская аллея, 2; электронная почта: asapt@aha.ru 2 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический факультет, 119991 Москва 3 Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, 119991 Москва
Поступила в редакцию 14.05.14 После доработки 09.06.14
Фактор некроза опухолей (TNF) играет ведущую роль в контролировании хозяином ранней фазы инфекций, вызванных Mycobacterium tuberculosis и M. avium. Ранее было установлено, что продукция TNF фагоцитами и Т-лимфоцитами критически важна для развития защитного иммунитета против M. tuberculosis, но значение продукции TNF В-лимфоцитами не было исследовано. В данной работе мы сравнивали мышей, у которых ген для TNF был генетически выключен только в В-лимфоцитах, с контрольными мышами-однопометниками и показали, что продукция TNF В-клетками является необходимым условием образования в ткани легкого генетически восприимчивых мышей агрегатов В-клеток. Весьма вероятно, что образование таких очагов — это скорее фактор патогенеза изучаемых инфекций, а не элемент защитного иммунитета, поскольку способность образовывать подобные компактные скопления В-лимфоцитов не влияет на тяжесть течения заболеваний, вызванных M. tuberculosis и M. avium.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: микобактериальные инфекции, В-лимфоциты, TNF, патология легких, модели на мышах.
Продукция клетками хозяина цитокина фактора некроза опухолей (TNF) — важный этап контроля инфекционного процесса, вызванного Mycobacterium tuberculosis. После захвата альвеолярными макрофагами микобактерий, попавших в легкие, начинается сложная цепь реакций иммунного ответа, среди которых синтез и секреция TNF является одной из самых ранних и важных для активации макрофагов и формирования гранулем [1]. Исследования in vivo, проведенные на мышах с инактивированным геном, кодирующим TNF (ген tnfa), убедительно показали, что отсутствие этого цитокина приводит к неспособности хозяина контролировать инфек-
* Адресат для корреспонденции.
цию [2, 3]. От секреции TNF критически зависит стабильность архитектуры туберкулезных гранулем, разрушение которых приводит к дис-семинации инфекции [4]. Важная роль TNF в контроле туберкулезной инфекции у человека обнаружилась при лечении антителами к TNF больных ревматоидным артритом и болезнью Крона. Оказалось, что такая терапия иногда приводит к реактивации туберкулеза, латентными бессимптомными носителями которого были пациенты [5].
TNF синтезируется разнообразными клетками иммунной системы: макрофагами, нейтро-филами, дендритными клетками и лимфоцитами. Общепринята точка зрения, что Т-клетки, в первую очередь CD4+, и макрофаги являются
основными звеньями защитного противотуберкулезного иммунного ответа, контролирующего инфекцию [6]. Вполне естественно, что после появления методов генетического выключения генов в отдельных популяциях клеток, было проведено исследование течения туберкулезной инфекции у мышей с «выключенным» геном tnfa только в Т-лимфоцитах, или только в макрофагах и нейтрофилах. Оказалось, что избирательное блокирование продукции TNF Т-клет-ками не влияет на течение инфекции в острой фазе, но утяжеляет хроническую фазу инфекции. Напротив, отсутствие продукции TNF в макрофагах и нейтрофилах сильно влияет на начальную фазу инфекции. Если же TNF не продуцировался ни миелоидными клетками, ни Т-клетками, это приводило к тяжелым последствиям, сходным с теми, что наблюдались при системном нокауте гена Tnf [7].
При исследовании особенностей инфекционного процесса, вызванного M. tuberculosis, участию В-клеток в протекции и патогенезе уделялось гораздо меньше внимания. Тем не менее В-лимфоциты могут оказывать влияние на течение инфекции на разных уровнях. Они не только продуцируют антитела, но и выступают в роли антиген-презентирующих клеток (АПК), а также могут регулировать иммунный ответ за счет продукции различных цитокинов и хемо-кинов. Например, показано, что у зараженных M. tuberculosis мышей линии CBA/N-xid с сильно редуцированной популяцией В-клеток и у мышей B-cell/-, вообще не имеющих В-лимфо-цитов, в легких повышен уровень IL-10, цито-кина, играющего важную роль в регуляции воспаления [8, 9, 10]. В некоторых моделях туберкулеза у мышей показана эффективная терапия моноклональными антителами к различным антигенам микобактерий [11, 12].
Важно отметить, что при туберкулезе у человека, мышей и обезьян В-лимфоциты в легких образуют скопления и формируют компактные структуры, похожие на фолликулы вторичных лимфоидных органов [13—17]. У человека и мыши эти структуры обнаруживаются недалеко от некротических гранулем, причем в экспериментальной модели было показано, что скоплений В-кле-ток (СВК) больше в легких генетически более чувствительных мышей и только у них происходит развитие гипоксии и некротизация гранулем [16]. Кроме того показано, что у мышей с дефицитом В-лимфоцитов туберкулез легких сопровождается более сильным воспалением с нарушенной организацией гранулем [9]. Отсюда следует предположение, что СВК формируются либо в попытке хозяина локализовать иммунный ответ, либо как следствие неэффективности ответа.
Поскольку необходимость TNF для поддержания структурной целостности туберкулезных гранулем надежно установлена [4], возник вопрос о возможном вкладе TNF, продуцируемого В-клетками, в организации СВК и роли этого процесса в протекции или патогенезе инфекции. В связи с этим, в данной работе мы исследовали течение инфекций, вызванных двумя возбудителями, M. tuberculosis и Mycobacterium avium, и образование СВК при этих инфекциях у мышей дикого типа и мышей B-TNF-/- с выключенным геном Tnfa в В-клетках.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Экспериментальные животные. В работе были использованы мыши, полученные на генетической основе линии C57BL/6 и несущие модифицированный для последующей делеции ген tnfa, а также Сге-рекомбиназу под контролем В-кле-точного промотора (CD19-Cre+/-TNFflox/flox) [18]. Контрольные группы были представлены мышами дикого типа (TNFflox/flox), полученными из того же помета при скрещивании мышей с генотипом CD19-Cre+/-TNFflox/flox c мышами с генотипом TNFflox/flox. Животных разводили в свободных от специфических для мыши инфекционных агентов условиях (specific pathogen free — SPF) на базе питомника для лабораторных животных SPF-категории «Пущино» ИБХ им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН. Генотипы животных определяли методом ПЦР по ранее опубликованным протоколам [18, 19]. Затем экспериментальных животных переводили в питомник НИИ туберкулеза РАМН, где содержали в обычных условиях, с доступом к корму и воде ad libitum.
Исследования также проводили на мышах инбредных линий СВА и СВА/N-xid в возрасте 2—3 мес. В работе были использованы животные обоих полов, поскольку предварительные исследования не выявили различий по характеру инфекции между самцами и самками. Линии в питомнике поддерживали братско-сестрински-ми скрещиваниями.
Культура микобактерий и заражение. В работе использовали Mycobacterium tuberculosis H37Rv (МТБ) из коллекции лаборатории иммуногене-тики Института туберкулеза, размноженные в жидкой среде Дюбо и хранившиеся аликвотами по 108 КОЕ/мл при —70°. Для заражения животных использовали фильтрованную культуру ми-кобактерий. Мышей инфицировали в аэрозольной камере фирмы «GlasCol» (США) при предварительно подобранных условиях, обеспечивающих дозу инфекции 102 КОЕ/мышь [20].
Mycobacterium avium (МА), условно-патогенный для человека вид микобактерий, который вызывает у мышей C57BL/6 дикого типа летальную легочную инфекцию, сопровождающуюся образованием СВК в легких [16], размножали и хранили в идентичных условиях. Мышей заражали в аэрозольной камере в дозе 104 КОЕ/мышь, поскольку вирулентность M. avium значительно ниже, чем M. tuberculosis.
Определение количества микобактерий в органах зараженных животных. В разное время после заражения (8 недель для МТБ и 16 недель для МА) определяли количество микобактерий во внутренних органах. Для этого стерильно выделяли легкие и селезенки зараженных животных, гомогенизировали в 2 мл физиологического раствора, готовили серийные десятикратные разведения гомогенатов органов и высевали на чашки Петри с агаром Дюбо («Difco», США) по 50 мкл на чашку. Чашки инкубировали при 37°, через 18—20 дней подсчитывали количество колоний на чашке и пересчитывали их количество на орган (КОЕ/орган).
Иммуногистохимическое исследование легких. Для исследования образования СВК в легких зараженных мышей готовили с помощью криостата серийные срезы толщиной 6—8 мкм. Далее проводили окраску мечеными монокло-нальными антителами к поверхностному маркеру CD19. Для этого срезы легкого фиксировали в холодном ацетоне в течение 30 мин, затем срезы высушивали при комнатной температуре и промывали в PBS. Для блокирования неспецифического окрашивания на срезы наносили 10%-ную козью сыворотку на 15 мин согласно рекомендации фирмы-производителя. Затем на срезы наносили моноклональные антитела анти-CD19 (rat anti-mouse, «BD-PharMingen», США), разведенные 1 : 50 в PBS, и оставляли их во влажной камере при комнатной температуре на 1 ч. Все дальнейшие процедуры проходили при этих условиях. Для контроля специфичности окрашивания на контрольные срезы первичные антитела не наносили, а инкубировали их в присутствии PBS во влажной камере. Затем срезы промывали в PBS (три раза по 2 мин) и наносили на них вторичные меченые биотином антитела (mouse anti-rat, «BD-PharMingen», США), разведенные 1 : 50 в PBS на 30 мин. После отмывки наносили раствор пероксидазы хрена, меченной стрептавидином, и инкубировали в течение 30 мин. Затем срезы тщательно отмывали в PBS. Далее на срезы наносили раствор диаминобензидина (DAB) на 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.