БИОФИЗИКА, 2010, том 55, вып.1, c.75-82
== БИОФИЗИКА КЛЕТКИ =
УДК 577.1
ОКИСЛЕНИЕ ЛЕЦИТИНА В ПРИСУТСТВИИ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА И ЕГО КОМПЛЕКСА С ИОНАМИ
ДВУХВАЛЕНТНОГО ЖЕЛЕЗА
© 2010 г. Ю.В. Шаталин* **, А.Н. Шмарев**
*
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, 142290, Пущино Московской области, ул. Институтская, 3;
E-mail: it@rambler.ru
**
Пущинский государственный университет, 142290, Пущино Московской области, пр. Науки, 3
Поступила в p едакцию 10.03.09 г.
Изучена способность флавоноида дигидр окверцетина влиять на пр оцесс накопления активных форм кислорода и метаболитов окислительного стресса - карбонильных соединений. На модели окисления лецитина показано, что дигидрокверцетин проявляет пр ооксидантный эффект в щелочной области рН, тогда как пр и нейтральных и кислых значениях рН дигидрокверцетин является эффективным антиоксидантом. В присутствии ионов двухвалентного железа, катализирующих реакцию Фентона, дигидрокверцетин образует комплекс с металлом, который проявляет антиоксидантную активность в области высоких значений рН. Обнаружено, что окисление лецитина в пр исутствии 20-200 мкМ сульфата железа (II) ингибируется дигидр о -кверцетином до концентр ации 3,2 мМ. П ри более высоких его концентрациях в пр исутствии ионов двухвалентного железа наблюдается увеличение накопления малонового диальдегида, что свидетельствует о наличии прооксидантной активности дигидрокверцетина.
Ключевые слова: антиоксидант, прооксидантная активность, флавоноид, перекисное окисление липидов, малоновый диальдегид.
Флавоноиды принадлежат к одному из классов растительных полифенолов, обладающих широким спектром биологического действия. По одной из гипотез [1], флавоноиды выполняют в растениях роль защитных агентов при различных стрессах, участвуя в предотвращении образования нестабильных радикалов при воздействии УФ -излучения и температурного стр есса. В организме животных флавоноиды не образуются, а поступают с пищей. В пр оцессе усвоения флавоноиды частично претерпевают ряд изменений и выводятся из организма в виде различных метаболитов, преимущественно фенольных кислот, а также в неизменном виде. Активное исследование биологической активности флавоноидов начинается с 1936 г. с работы венгерского биохимика Сент-Дьёр дьи, выделившего в чистом виде витамин Р (рутин). Позднее было показано, что помимо капилля-роукрепляющего действия флавоноиды (квер-цетин, рутин, гесперитин и др.) проявляли и другие виды биологической активности [2], в
Сокращения: ПОЛ - перекисное окисление липидов, МДА - малоновый диальдегид, ТБК-АП - активные продукты, реагирующие с тиобарбитуровой кислотой, ДГК -дигидрокверцетин, АФК - активные формы кислорода.
том числе иммуномодулирующую [3-6], противоопухолевую [7] и некоторые другие [8-10]. Для объяснения столь широкого действия флавоноидов были предложены несколько гипотез, основывающихся на их антоксидантной и ме-таллсвязывающей способности. Наличие высокой антиоксидантной активности этого класса соединений в некоторой степени объясняет способность флавоноидов снижать р иск р азвития спонтанных опухолей, их противовоспалительную активность, снижение риска возникновения сердечно-сосудистых заболеваний при употреблении в пищу продуктов, богатых полифенолами [11-13].
Другой возможный антиоксидантный механизм действия полифенолов обусловлен их способностью связывать металлы с образованием комплексов. Известно, что металлы с переменной валентностью часто вовлечены в процесс генерации свободных радикалов, в частности, катализируя реакцию разложения пероксида водорода и гидропероксидов липида (ЬООЫ) с образованием гидроксильного или алкоксиль-ного радикала соответственно [14]. Флавоноид, хелатируя металл, может изолировать эти ионы
и, таким образом, пр едотвращать формир ова-ние свободных радикалов [15].
C другой стор оны, группой ученых под руководством Наруми Cугихара [16] на модели окислительного повр еждения гепатоцитов, индуцированного гидропероксидами, было подтверждено наличие у флавоноидов проокси-дантных свойств. В этой работе были проана-лизир ованы пр о/антиоксидантные свойства ми-рицетина, кверцетина, фисетина, кэмпферола, мор ина, лютеолина, апигенина и таксифолина (дигидроквер цетина). Необходимо отметить, что в цитированной выше р аботе таксифолин проявлял как анти-, так и прооксидантную активность в зависимости от концентраций Fe2+, но в присутствии других металлов переменной валентности таксифолин обладал только анти-оксидантными свойствами. П ри этом было высказано предположение, что изменение про- и антиоксидантных свойств флавоноидов напрямую зависит от изменения окислительно-восстановительного потенциала металла, входящего в состав комплекса, и может объясняться циркуляцией окисленного-восстановленного состояния данного металла в системе. Сходные работы по изучению поведения флавоноидов в присутствии металлов переменной валентности были выполнены в группах В.А. Костюка [17] и И .Б. Афанасьева [18]. В этих работах внимание было сосредоточено на изучении комплекса рутина и меди, проявляющего высокую анти-оксидантную и гепатопротекторную активность в сравнении со свободным флавоноидом. На основании результатов, полученных в этих р а-ботах, можно предположить, что в связанном с металлом состоянии флавоноид обладает несколько иными окислительно-восстановительными свойствами. Таким образом, изучение пр о- и антиоксидантных свойств комплексов флавоноидов с переходными металлами позволит определить возможность участия полифенолов в индукции окислительного стресса и условия возникновения у флавоноидов проок-сидантных свойств.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовали: лецитин (Sigma, США), пер оксид водорода, тиобарбитуровую кислоту, фосфор ную кислоту Na2HPO4-12H2O, NaH2PO4-2H2O, цитрат натрия, лимонную кислоту, FeSO4 (ЗАО «Мосреактив», Москва), ди-гидрокверцетин (ДГК) (НПФ «Флавит», ИБП РАН, Пущино).
Влияние флавоноида на процесс образования продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ), таких как малоновый диальдегид
(МДА) и монокарбонильные соединения, оценивали по реакции образующихся альдегидов с тиобар битуровой кислотой, или так называемых активных продуктов, реагир ующих с тио-барбитур овой кислотой (ТБК-АП).
Исследование процесса окисления лецитина в присутствии дигидрокверцетина и ионов двухвалентного железа во времени. В пробир ки, содержащие 1 мл эмульсии лецитина (100 мг/мл), добавляли дигидроквер цетин и сульфат железа (II) в концентрациях от 0 до 32 мМ для фла-воноида и от 0 до 10 мМ для соли железа в разных комбинациях. Далее раствор липида ин-кубир овали пр и 37°С в течение 16 сут и анализировали на содержание карбонильных соединений.
Исследование влияния рН среды и присутствия пероксидов в растворе на накопление малонового диальдегида в процессе окисления лецитина. Для оценки влияния рН на процесс окисления лецитина в присутствии ДГК и железа (II) раствор лецитина готовили в цитрат-ном (0,1 М ра створ лимонной кислоты/цитрата натрия, рН 4,0) или фосфатном (0,1 М ра створ Ка2НР0412Н20/КаН2Р04-2Н20, рН 8,0) буферных растворах.
В пробирки, содержащие 1 мл эмульсии лецитина (100 мг/мл) в буферном раствор е, добавляли ДГК, Ре804 или комплекс ДГК-Ре(П) в концентрациях 0; 5 и 10 мМ. Комплекс ДГК-Ре(П) готовили, предварительно смешивая эквивалентные количества водных растворов РеБ04 и флавоноида.
Затем растворы липида инкубировали при 37°С в течение 1 и 24 ч и далее анализировали на содержание карбонильных соединений.
Аналогичным образом проводили инкубацию растворов липида в присутствии 10 мМ пероксида водорода.
Регистрация продуктов перекисного окисления липидов. К 50 мкл суспензии липида добавляли 450 мкл раствора тиобарбитуровой кислоты (2,5 мг/мл) в 2% ортофосфорной кислоте. Полученный р аствор инкубир овали при 100°С в течение 1 ч, и затем окрашенный продукт экстрагировали 500 мкл н-бутанола. Далее регистр ировали в диапазоне 400-650 нм спектр спиртового экстракта (спектрофотометр Сагу-100 Бсаи, Уапаи, США).
Наличие пиков адсо рбции, хар актерных для образования аддуктов с ТБК при 460 и 500 нм, обусловлено образованием монокарбонильных соединений (альдегидов), реагирующих с ТБК, тогда как для продукта конденсации ТБК-МДА характерно поглощение при 532 нм. Значения оптической плотности при 460, 500 и 532
IV ОН О'
Сх ема 1. Окислительно-восстановительные пр евр ащения дигидр оквер цетина.
нм, характерные для максимумов поглощения соответствующих ТБК-К С (кар бонильных со -единений), анализир овали для каждого обр азца индивидуально.
С татистический анализ пр оводили с использованием г-критерия Стьюдента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В данной работе изучены антиоксидантные свойства дигидр оквер цетина и его комплекса с ионами двухвалентного железа. Антиоксидант-ную активность можно определять, используя р азличные методы: спектр офотометр ию, люминесценцию, поляр огр афию. Наиболее часто для этой цели используют метод люминесценции в модельной системе: люминол-Ы2О2-катализа-тор, где в качестве катализатор а могут выступать пер оксидаза, гемоглобин или соли металлов переменной валентности [19].
Анализ изменения интенсивности ХЛ (данные не представлены) от концентрации анти-оксидантов позволил установить, что концентр ация дигидр оквер цетина, тр ебуемая для снижения хемилюминесценции вдвое, составляет
3,3-10-5 ± 0,7-10-5 М, и по данным, полученным ранее в нашей лаборатории, занимает промежуточное положение между такими известными антиоксидантами, как а-токофер ол и аскор би-новая кислота [21].
Данная модельная система не является оптимальной для изучения про/антиоксидантых свойств гидр офобных соединений из-за их слабой ра створ имо сти в воде и вы сокого коэффициента распр еделения октанол-вода (для дигид-р оквер цетина log Р = 1,82 ± 0,41). Поэтому в дальнейшем нами была использована модель окисления лецитина под действием кислорода воздуха и пер оксида водор ода.
В пр оцессе реакции ДГК с активными фо р-мами кислорода (АФК) образуются промежуточные фор мы, обладающие как пр о-, так и антиоксидантной активностью (схема 1). Как видно из сх
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.