НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 3, с. 222-228
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 611.81.03
ОНТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПАТТЕРН ЭКСПРЕССИИ БЕЛКА ГЛЮКОКОРТИКОИДНЫХ РЕЦЕПТОРОВ И ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА NGFI-A В ГИППОКАМПЕ САМЦОВ КРЫС ПОСЛЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО СТРЕССА © 2013 г. Н. Э. Ордян*, С. Г. Пивина, А. Ю. Галеева, В. В. Ракицкая, В. К. Акулова
Лаборатория нейроэндокринологии, Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
Иммуногистохимическим методом изучены особенности экспрессии белка глюкокортикоидных рецепторов (ГР) в областях гиппокампа в постнатальный период развития самцов крыс — потомков матерей, подвергнутых иммобилизационному стрессу с 15 по 19 день беременности. Кроме того, методом Вестерн блоттинга в этой мозговой структуре исследовано изменение экспрессии белка транскрипционного фактора у пренатально стрессированных животных. Показано, что
пренатальный стресс вызывает существенное снижение общего числа ГР-иммунопозитивных клеток в СА1 поле гиппокампа и зубчатой извилине в первую неделю жизни крысят, увеличение их количества и количества сильно-иммунопозитивных клеток во вторую неделю и затем повторное снижение числа клеток, экспрессирующих ГР, на третьей неделе жизни. Экспрессия белка в гиппокампе пренатально стрессированных самцов была повышена в первую и вторую неделю жизни, но не изменена в третью неделю по сравнению с контрольными животными. Сделано заключение, что деструктивные эффекты пренатального стресса на развивающийся гиппокамп могут быть обусловлены изменением числа ГР в ранний постнатальный период развития, тогда как индукция в гиппокампе пренатально стрессированных самцов в ранний неонатальный период развития, вероятнее всего, носит адаптивный характер.
Ключевые слова: пренатальный стресс, гиппокамп, глюкокортикоидныерецепторы, ШОП-Л, крыса.
Б01: 10.7868/81027813313030102
Одним из важнейших достижений биологии и медицины последних десятилетий явилось понимание роли глюкокортикоидных гормонов в развитие организма на ранних стадиях онтогенеза [1]. Глюкокортикоидные гормоны, выступая в качестве морфогенетического фактора, оказывают существенное влияние на становление различных систем организма и, в первую очередь, головного мозга. Как избыток, так и недостаток этого стероида в перинатальный период развития "программирует" формирование нейромедиаторных и нейроэндокринных систем, что во взрослой жизни реализуется в существенных нарушениях в психоэмоциональной сфере и способности к адаптации к различным стрессорным воздействиям [2].
Стрессирование беременных самок крыс в последнюю треть гестации создает у их плодов повышенный уровень кортикостерона в крови, причем такой высокий уровень кортикостерона сохраняется у потомков стрессированных крыс и в раннем постнатальном периоде развития [3]. По-
*Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6, тел. (812)328-07-01; e-mail: neo@infran.ru.
казан деструктивный эффект материнского стресса на развивающийся гиппокамп плодов, что выявлялось только у потомков мужского пола [4]. В половозрелом возрасте у пренатально стрес-сированных животных изменяется характер стрессорной активации гипоталамо-гипофизар-но-адренокортикальной системы (ГГАС), наблюдаются нарушения в обучении, депрессивно-подобном поведении и уровне тревожности [5]. Сходные изменения в активности ГГАС и поведении наблюдаются и у животных, которых в раннем постнатальном онтогенезе (первые две недели жизни) подвергали длительному отъему от матерей [6, 7]. Следует отметить, что длительная материнская депривация, также как и пренаталь-ный стресс, приводит к подъему уровня кортико-стерона в крови в ранний постнатальный период развития [8]. В литературе высказывается мнение, что, по крайней мере, эффекты отъема от матери опосредуются длительным изменением экспрессии белка глюкокортикоидных рецепторов (ГР) в гиппокампе — структуре головного мозга, имеющей существенное значение как в регуляции активности ГГАС, так и в реализации различ-
ных поведенческих актов [7, 9]. Можно полагать, что у пренатально стрессированных крыс ГР гип-покампа также подвергаются длительной модификации в результате повышенного уровня кор-тикостерона в раннем постнатальном онтогенезе.
Действительно, нами было обнаружено, что в результате пренатального стрессирования у крыс после рождения изменяется паттерн экспрессии белка ГР в гиппокампе в целом, что было показано методом Вестерн блоттинга [10]. Учитывая определенную гетерогенность гиппокампальной формации, значительный интерес представляют сведения о распределении ГР в различных полях гиппокампа и зубчатой извилине у пренатально стрессированных крыс в течение первых недель жизни. С этой целью в данной работе был использован метод иммуногистохимии, позволяющий как локализовать ГР в отдельных областях гиппо-кампа, так и дать количественную оценку экспрессии их белка.
В качестве механизма, посредством которого стрессорные воздействия в раннем онтогенезе влияют на ГР гиппокампа, рассматривается транскрипционный фактор NGFI-A (nerve growth fac-tor-inducible protein-A) [11]. Ген, кодирующий белок NGFI-A, относится к семейству так называемых ранних генов и активируется различными стимулами, включая стрессорные воздействия [12]. Одной из важнейших мишеней NGFI-A является ген ГР, промотор которого содержит 16 GC боксов, формирующих основу консенсусной последовательности для связывания NGFI-A [13]. Полагают, что именно этот транскрипционный фактор изменяет экспрессию ГР в нейронах гип-покампа, выступая в качестве эпигенетического фактора, определяющего эффекты стрессорных воздействий в раннем онтогенезе [11]. В связи с этим, мы также исследовали экспрессию белка NGFI-A в гиппокампе пренатально стрессиро-ванных самцов в те же возрастные периоды, что и экспрессию белка ГР.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на крысах линии Спрег—Доули. Моделирование пренатального стресса осуществлялось следующим образом: беременных самок (n = 12) с 15 по 19 день гестации подвергали ежедневному иммобилизационному стрессу в узких пластиковых пеналах размером 20 х 7 х 6 см в условиях повышенной освещенности, создаваемой лампой мощностью 40 Вт, расположенной на уровне 40 см. Контрольных беременных самок (n = 12) оставляли интактными. Для получения экспериментальных животных беременных самок крыс перед родами рассаживали в индивидуальные клетки и далее ежедневно проводили наблюдение с целью определения даты родов. День обнаружения новорожденных кры-
сят считали 0 днем жизни. На следующий день число крысят в пометах выравнивали до 8 животных (4 самца и 4 самки). Пометы, где обнаружено резкое преобладание животных одного пола, из исследования исключали. С этого момента животные не подвергали никаким воздействиям до момента тестирования. В экспериментах использовали только потомков самцов.
Самки с пометами содержались в обычных условиях вивария без ограничения доступа к воде и пище. Все исследования проводились согласно этическим принципам, изложенным в Европейской конвенции по защите позвоночных животных (86/609/ЕЕС), используемых для экспериментальных исследований. Протоколы опытов были утверждены Комиссией по гуманному обращению с животными Института Физиологии им. И.П. Павлова РАН.
В определенные дни постнатальной жизни (7, 17 и 24) крысят (n = 6 для каждого возрастного срока) быстро извлекали из домашней клетки и декапетировали. Из каждого помета отбирали по 2 самца с целью исключить влияние особенностей материнского поведения на развитие крысят. Экспрессию белка ГР в областях гиппокампа исследовали методом количественной иммуноци-тохимии. Для этого мозг быстро извлекали из черепной коробки и помещали в 4% раствор пара-формальдегида в 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.3) 1 час, а затем 48 часов при +40°C. Далее осуществлялась стандартная гистологическая обработка ткани, которая заключалась в проводке материала через этиловые спирты возрастающей концентрации (70, 80, 96, 96% по 1 ч) и через бу-танолы (1 ч и ночь). Затем материал проводили через 4 порции ксилола (по 15 мин) и заливали в парафиновые блоки. Далее при помощи микротома изготавливали серии чередующихся срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 5— 6 мкм на уровне —2.80 мм от брегмы. С помощью метода немеченых антител (авидин-биотинового) и иммунопероксидазной реакции проводили выявление иммунореактивного вещества (антигена). После стандартных процедур депарафиниза-ции, регидратации и демаскировки антигена (кипячение срезов в 0.01 М цитратном буфере (pH 6.0) под давлением в течение 1 мин), срезы в течение ночи при +4°C инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами к ГР (Santa Cruz Biotechnology Inc., USA; 1 : 100). Далее на срезы наносили универсальную систему авидин-биотинового комплекса (ABC,Vector Laboratories, Inc, USA) и оставляли инкубироваться 30 мин при комнатной температуре. После инкубации с АВС-комплексом стекла промывали в фосфатном буфере 3 раза по 5 мин. Для визуализации реакции связывания антитела с антигеном использовали диаминобензидиновый кит (DAB Substrate kit,Vector Laboratories, Inc, USA). После
n
300 250 200 150 100 50 0
II
17
24
□ 7
7 □ 2
17 24
Рис. 1. Изменение количества иммунореактивных клеток в зубчатой извилине гиппокампа самцов крыс в постнатальный период развития. 1 — число сильно-иммунореактивных клеток (и); 2 — число слабоимму-нореактивных клеток (и). I — контрольные крысы; II — пренатально стрессированные животные. По оси абсцисс — возраст животных (день жизни). * — Статистически значимые (р < 0.05) отличия от предыдущего возрастного срока; # — статистически значимые (р < 0.05) различия между контрольными и пренатально стрес-сированными крысами.
обезвоживания и заключения срезов в желатин проводили количественный анализ иммунореак-тивности нейронов с использованием системы, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optronic, Germany) и компьютера IBM PC с программным обеспечением Videotest Master Morphology. На основании оценки оптической плотности иммунопозитивные клетки разделяли
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.