ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 543
ОПРЕДЕЛЕНИЕ АНТИБИОТИКА ФТОРХИНОЛОНОВОГО РЯДА ЛЕВОФЛОКСАЦИНА В МОЧЕ МЕТОДОМ ПОЛЯРИЗАЦИОННОГО
ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО ИММУНОАНАЛИЗА © 2015 г. И. А. Шанин*, 1, А. Р. Шаймарданов*, Нгуен Ти Диу Тхай**, С. А. Еремин*
*Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова, химический факультет
119991 Москва, Ленинские горы, 1 Е-таИ: numenor-08@mail.ru **Институт Биотехнологии Вьетнамской Академии Науки и Технологий Поступила в редакцию 24.06.2014 г., после доработки 23.10.2014 г.
Разработана методика поляризационного флуоресцентного иммуноанализа (ПФИА) для определения левофлоксацина в моче. Синтезированы флуоресцеин-меченные антигены (трейсеры) с различными фторхинолонами и флуоресцентными метками. Трейсер на основе гареноксацина, меченного 4-ами-нометилфлуоресцеином, и поликлональные антитела к левофлоксацину наиболее чувствительны для определения фторхинолонов. Разработан ПФИА для определения левофлоксацина с пределом определения 1.0 нг/мл и диапазоном определяемых концентраций от 2.5 до 50 нг/мл. Разработан однореа-гентный ПФИА для определения левофлоксацина с пределом определения 0.5 нг/мл и диапазоном определяемых концентраций от 1 до 10 нг/мл. Методики апробированы при определении левофлокса-цина в моче.
Ключевые слова: поляризационный флуоресцентный иммуноанализ, антибиотик, фторхинолоны, левофлоксацин.
Б01: 10.7868/80044450215060171
Сегодня невозможно представить медицину без синтетических противомикробных препаратов. Их используют при различных инфекционных заболеваниях, причем часто для проведения наиболее оптимального курса лечения важно поддерживать терапевтическую концентрацию действующего вещества в крови. Существуют два варианта реализации такого подхода: определение действующего вещества в сыворотке [1] или плазме или контроль его выведения с мочой. Сыворотка представляет собой очень непростой объект для анализа из-за сложного состава и, как следствие, сильного влияния матрицы. В случае мочи эффект матрицы значительно проще нивелировать, кроме того, вещества в значительной степени концентрируются и нет необходимости в разработке особо чувствительных методов анализа. Такой контроль актуально проводить у пациентов, проходящих длительный курс антибиотикотерапии. Номенклатура лекарственных веществ, применяемых для лечения инфекционных заболеваний, очень велика, но все они относятся к нескольким классам: пенициллинам, цефалоспоринам, сульфаниламидам, аминогликозидам, тетрациклинам, фторх-инолонам и др. В последние годы широко стали применять фторхинолоны — известно более 30 со-
единений этого класса [2], на базе каждого из которых создан ряд лекарственных препаратов. Такое разнообразие противомикробных веществ ставит непростую задачу контроля за их содержанием в биологических объектах.
Класс хинолонов/фторхинолонов включает четыре поколения, которые различаются по активности к микроорганизмам. Некоторые фторх-инолоны обладают стереоизомерией. Например, офлоксацин, фторхинолон второго поколения, является рацематом, а левофлоксацин — фторхи-нолон уже третьего поколения, является левовра-щающим стереоизомером офлоксацина. Следует отметить, что левовращающая форма этого антибиотика проявляет в несколько раз большую биологическую активность, правовращающая форма офлоксацина является балластной. Таким образом, определять необходимо левовращающий стерео-изомер.
Для выполнения таких задач необходимо разрабатывать быстрые, высокоточные и специфичные методики при сравнительно невысокой стоимости анализа. Всеми перечисленными качествами обладают иммунохимические методы (ИХМ). В их основе лежит высокоспецифичная реакция
антиген—антитело. Особенностью ИХМ является возможность определять концентрацию целевого антигена без сложной пробоподготовки (извлечение индивидуального вещества), достаточно нивелировать эффект матрицы анализируемого объекта.
Одним из наиболее быстрых иммунохимиче-ских методов является поляризационный флуоресцентный иммуноанализ. Через 10—15 мин, включая простейшую пробоподготовку, уже можно получить ответ. Кроме того, возможна разработка однореагентного метода ПФИА, что делает его еще более простым, хотя и не всегда таким же быстрым.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Сигнал поляризации флуоресценции и интенсивности измеряли на TDxFLx анализаторе фирмы Abbott Laboratories (США) в режиме "Photo Check". Результаты обрабатывали в программе ORIGIN 8.5.1. Кинетику связывания антител с трейсером исследовали на приборе Beacon 2000 фирмы Panvera (США).
Химические вещества (субстанции, реагенты).
Стандарты и другие химические вещества: R-офлоксацин фирмы Santa Cruz Biotechnology, США; офлоксацин (R,S), левофлоксацин (ЛЕВ), гареноксацин (ГАР), марбофлоксацин, руфлокса-цин, пефлоксацин, гатифлоксацин, клинафлокса-цина гидрохлорид, сарафлоксацина гидрохлорид, ломефлоксацин, тозуфлоксацин, спарфлоксацин, данофлоксацин, дифлоксацин, пазуфлоксацин, моксифлоксацин, норфлоксацин, ципрофлокса-цин, энрофлоксацин, пипемидиевая, налидиксо-вая, оксолиниевая кислоты, орбифлоксацин, энок-сацин, надифлоксацин, циноксацин, флюмеквин; буферные растворы, соли и другие расходные реагенты: десятиводный тетраборат натрия, борная кислота, Твин 20, N-гидроксисукцинимид, 1-этил-3-(диметиламинопропил)карбодиимида гидрохлорид, 4-аминометилфлуоресцеин (4-АМФ) фирмы Sigma-Aldrich Corporation, США. Лекарственные препараты Таваник в дозировке 250 мг фирмы Са-нофи Винтроп Индустрия (Франция) и Офлок-син в дозировке 200 мг фирмы Зентива Фарма (Чешская Республика) были приобретены в аптеках Москвы. Поликлональные антитела, специфичные к левофлоксацину, получены ранее в нашей лаборатории иммунизацией кроликов калифорнийской породы конъюгатом левофлоксацина с катионизированным сывороточным альбумином и использованы для иммуноферментного определения левофлоксацина в молоке [3].
Синтез трейсеров. Использовали соотношение га-реноксацина, 1 -этил- 3 - (диметиламинопропил)кар -бодиимида гидрохлорида, N-гидроксисукцинимида и флуоресцентной метки соответственно 2 : 4 : 4 : 1. Гареноксацин растворяли в диметилформамиде и прибавляли 1 -этил- 3 - (диметиламинопропил)кар-
бодиимида гидрохлорид и ^гидроксисукцинимид. Инкубировали в течение ночи при комнатной температуре и постоянном перемешивании. На следующий день прибавляли флуоресцентную метку и инкубировали 5 ч. Очистку проводили методом тонкослойной хроматографии в системах подвижных фаз СНа3-СН3ОН^Н3 (25 : 10 : 2) и СНС13—СН3ОН (4 : 1). На рис. 1 представлена схема синтеза трейсера гареноксацина с 4-аминоме-тилфлуоресцеином. Трейсеры с аминофлуоресцеи-ном, флуоресцеин-тиокарбамил этилендиамином, флуоресцеин-тиокарбамил пропилендиамином, флуоресцеин-тиокарбамил гексилендиамином синтезированы аналогично.
Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ представляет собой гомогенный конкурентный метод анализа. Схема проведения эксперимента в данной работе: к 50 мкл образца/стандарта добавляли 500 мкл раствора трейсера и 500 мкл раствора антител [4]. На этапе разработки методики определения левофлоксацина определяли рабочие разведения трейсеров и антител. Растворы готовили с использованием 0.1 М боратного буферного раствора с добавлением 0.1% Твин 20 и 0.1% метанола. В данной работе интенсивность рабочего раствора трейсера доводили до 2000 единиц. Для проведения текущих экспериментов использовали свежеприготовленные растворы трейсеров с интенсивностью 2000 ± 100 единиц. Для определения рабочего разведения антител готовили серию их разведений по 0.5 мл с шагом разбавления 2 раза. Прибавляли 0.5 мл рабочего раствора трейсера и измеряли сигнал поляризации флуоресценции. По полученным данным строили графики в координатах сигнал—разведение и выбирали оптимальное, исходя из разницы между максимальным и минимальным сигналами для достижения наилучшей разрешающей способности системы. Рабочее разведение антител составило 5000.
Для каждой пары трейсер—антитело строили график зависимости сигнала от концентрации стандарта и находили диапазон линейности и предел определения. Лучшие результаты с антителами к левофлоксацину показал трейсер гаре-ноксацин, меченный 4'-аминометилфлуоресцеи-ном. Каждую концентрацию измеряли трижды. Предел определения составил 1 нг/мл. Диапазон линейности (рис. 2) от 2.5 до 50 нг/мл для стандартных растворов левофлоксацина в 0.01 М фосфатном солевом буферном растворе. Уравнение градуировочного графика имеет вид:
тР/тР0 = (0.95 ± 0.01) - (0.27 ± 0.0Щ с, Я2 = 0.995 (Р = 0.95),
где тР — значение поляризации флуоресценции для образца/стандарта, тР0 - значение поляризации флуоресценции для нулевого стандартного
o
hn
hn
cooh
1-Этил-3-(диметиламинопропил)-карбодиимид
ch3
+ c2h5n=c=n-ch2ch2ch2—n
^ c2h5
0 o \ N-Гидроксисукцинимид n
o ^ ^O
nh O N O h c oh
1 h2c -- hn
f к ^f- o
ch3
o o о o-n o
f
2 \
n-ch
3
f
h3c
о о
hn
oh
о
4-АМФ
Рис. 1. Схема синтеза трейсера гареноксацина с 4-аминометилфлуоресцеином (ГАР—4АМФ).
mP/mP0 1.0
(а)
1
10 100 1000 Сдев, нг/мл
10
Сдев> нг/мл
Рис. 2. Градуировочные графики классической (1) и однореагентной (2) систем анти-ЛЕВ/ГАР—4АМФ.
2
1
1
раствора, с — концентрация левофлоксацина в образце/стандарте.
Однореагентный ПФИА. Данный формат ПФИА отличается тем, что трейсер и антитела изначально представляют один реагент, т.е. в определенной пропорции их объединяют в концентриро-
ванном виде и непосредственно перед анализом разбавляют. Исследовали кинетику связывания трейсера с антителами. Измерения проводили на приборе Beacon 2000 по программе: 37°C, интервалы между измерениями — 10 с и тремя последовательными измерениями между интервалами инкубации. Опыт показал, что большее число измере-
Рис. 3. Зависимости от времени изменения поляризации флуоресценции при образовании иммунного комплекса трейсера ГАР—4АМФ с антителами (а) и диссоциации трейсера из иммунного комплекса при различных концентрациях добавляемого левофлоксацина (б). сЛев> нг/мл: 1 — 0, 2 — 1, 3 — 2.5, 4 — 5, 5 — 10, 6 — 20, 7 — 50, 8 — 100, 9 — 500.
ний между интервалами дает искажение, так как на эти измерения также требуется вре
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.