научная статья по теме ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ С ХИТОЗАНОМ Химия

Текст научной статьи на тему «ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ С ХИТОЗАНОМ»

БИОХИМИЯ, 2006, том 71, вып. 3, с. 417 - 425

УДК 577.112.8

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНСТАНТ СВЯЗЫВАНИЯ ЛИПОПОЛИСАХАРИДОВ РАЗЛИЧНОЙ СТРУКТУРЫ C ХИТОЗАНОМ

© 2006 г. В.Н. Давыдова*, Г.А. Набережных, И.М. Ермак, В.И. Горбач, Т.Ф. Соловьева

Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН, 690022 Владивосток, пр. 100-летия Владивостока, 159; факс: (4232)314-050, электронная почта: viktoria@piboc.dvo.ru

Поступила в редакцию 20.04.05

Изучено взаимодействие эндотоксинов — липополисахаридов (ЛПС) различной степени полимеризации О-специфической цепи — с хитозаном с молекулярными массами 20 и 130 кДа с использованием конкурентного связывания ЛПС с комплексом хитозан—анионный краситель (тропеолин 000-2) и прямого связывания меченого [1251]-ЛПС с хитозаном, иммобилизованным на сефарозе 4В. Показано, что хитозан с молекулярной массой 20 кДа взаимодействует с ЛПС некооперативно, а иммобилизация поликатиона на сефарозе приводит к его связыванию с [1251]-ЛПС с положительной кооперативностью. При взаимодействии ЛПС с длинной О-специфической цепью с хитозаном с молекулярной массой 130 кДа отмечена отрицательная кооперативность. Определены константы связывания ЛПС с поликатионом и число мест связывания в расчете на одну аминогруппу хитозана. Показано, что на аффинность взаимодействия и стехиометрию комплексов ЛПС—хитозан значительное влияние оказывают структура ЛПС и его концентрация в реакционной смеси. Увеличение длины углеводных цепей ЛПС приводит к увеличению значений констант связывания и уменьшению количества связанного эндотоксина.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: липополисахарид, хитозан, тропеолин 000-2, константы связывания, О-специфи-ческая цепь ЛПС.

Эндотоксины — липополисахариды (ЛПС) — важные факторы патогенности грамотрицатель-ных бактерий. В основе многих биологических свойств эндотоксинов лежит их способность взаимодействовать с молекулами макроорганизма, в частности с растворимыми белками сыворотки, сывороточными липопротеинами и клеточными рецепторами различной природы [1]. Кроме того, при попадании в организм в составе бактериальной клетки ЛПС становятся мишенью для антибактериальных веществ полика-тионной природы, включающих в себя как бактерицидные белки организма хозяина, так и антибиотики, применяемые для лечения инфекции [2].

Принятые сокращения: ЛПС — липополисахариды; Х-ВМ — хитозан с молекулярной массой 130 кДа; Х-НМ — хитозан с молекулярной массой 20 кДа; Б0 и Бэкс — поглощения растворов соответственно до и после прибавления ЛПС; АДщх — разница поглощения комплекса тропео-лин—хитозан и раствора тропеолин—хитозан—ЛПС, соответствующего насыщению хитозана ЛПС; 0 — степень насыщения хитозана молекулами ЛПС; Кс — константа связывания.

* Адресат для корреспонденции и запросов оттисков.

Молекулярный механизм взаимодействия ЛПС с соединениями поликатионной природы еще недостаточно понятен. Общепризнанным считается факт, что основополагающими являются взаимодействия между отрицательно заряженными группами эндотоксина и положительно заряженными группами на связывающих его полимерах [2, 3]. Вместе с тем получены сведения о том, что формирование стабильных комплексов эндотоксин—поликатион является также и результатом гидрофобных взаимодействий [4]. Несмотря на большой интерес к этой проблеме, известны лишь ограниченные данные о стехиометрии комплексов, а также о влиянии структуры эндотоксина на процесс формирования комплексов [3, 5, 6]. Во многом это обусловлено природой самих ЛПС, молекулы которых состоят из гидрофобной (липид А) и гидрофильной (О-специфический полисахарид и олигосахарид кора) областей. Липид и внутренняя часть кора эндотоксина содержат отрицательно заряженные группы (фосфатные, пирофосфатные, карбоксильные [7]), которые главным образом обеспечивают его взаимодействие с различными поликатионными соединениями.

Благодаря амфифильной природе ЛПС в растворе способны образовывать агрегаты, надмолекулярная организация которых зависит как от условий растворения (температуры, концентрации полимера), так и от структуры эндотоксина [1, 6]. Это, в свою очередь, влияет на плотность упаковки макромолекул в агрегатах ЛПС и доступность заряженных групп для взаимодействия с поликатионами [8].

Ранее мы показали, что ЛПС взаимодействует с поликатионом природного происхождения (хитозаном), образуя стабильные комплексы различной стехиометрии. Состав этих комплексов и процесс их образования зависят как от структуры ЛПС, так и от параметров среды, в которой ведется комплексообразование [9, 10].

Настоящая работа является продолжением исследований в этом направлении. Ее цель — изучение процесса взаимодействия эндотоксинов различной степени полимеризации О-спе-цифической цепи с хитозаном в разбавленных растворах и определение констант связывания ЛПС с поликатионом с помощью метода конкурентного связывания эндотоксина с комплексом хитозан—анионный краситель (тропеолин 000-2), а также прямого связывания меченого [1251]-ЛПС с иммобилизованным на сефарозе хитозаном.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе были использованы хлорамин Т («Serva», Германия), сефароза 4В («Pharmacia», Швеция), Na125I (НПО «Изотоп», Россия), краситель тропеолин 000-2 (Orange-2) («Союзреак-тив», Россия). Краситель был очищен путем перекристаллизации из этанола. Все остальные реактивы имели классификацию х.ч. («Реахим», Россия) и использовались без дополнительной очистки.

Выделение и очистка ЛПС. ЛПС были выделены из бактерий Yersinia pseudotuberculosis 1В серовара, причем ЛПС-1 — из микроорганизмов, выращенных при 4°, экстракцией смесью фенол—хлороформ—петролейный эфир методом Галаноса [11], а ЛПС-2 — 45%-ным горячим фенолом методом Вестфаля [12]. ЛПС R-формы выделяли экстракцией бактериальных клеток, культивированных при 37°, горячим водным фенолом методом Вестфаля [12]. ЛПС-3 получали модифицированным методом Галаноса [13]. В эксперименте использовали фракцию, полученную из фенольного слоя осаждением ацетоном. Полученные ЛПС очищали от нуклеиновых кислот ультрацентрифугированием при 105 000 g. Моносахаридный состав и степень полимериза-

ции О-специфической цепи ЛПС устанавливали методом ГЖХ, получив моносахариды в виде ацетатов полиолов, как описано в работе [14], и использовав ксилозу в качестве внутреннего стандарта.

Введение радиоактивной метки в ЛПС. ЛПС-3 (2 мг) растворяли в 0,2 мл воды, добавляли 4 мг бромциана, и смесь перемешивали в течение 8 мин при 0°; рН 10,0 поддерживали добавлением 1 N раствора NaOH. Затем добавляли 1 мг тирамин-гидрохлорида, доводили рН до 8,0, добавив 0,2 M NaHCO3, и смесь перемешивали в течение 16 ч при 20°. Триаминированный ЛПС выделяли гель-хроматографией на сефадексе G-50 в фосфатном буфере (рН 5,0). Степень тираминиро-вания, определенная по поглощению при 280 нм, составила 2 моль тирамина на 1 моль ЛПС. Йодирование триаминированного ЛПС проводили с помощью хлорамина Т, как описано в работе [15]. Удельная радиоактивность [1251]-ЛПС составила 2 • 104 имп/мин на 1 мкг.

Получение хитозанов. Хитозаны с молекулярными массами 130 (Х-ВМ) и 20 кДа (Х-НМ) были получены описанным ранее способом [16].

Титрование комплекса тропеолина 000-2 с хи-тозаном раствором ЛПС. К 80 мкл 0,005 М фосфатного буфера (рН 5,0) добавляли 40 мкл раствора тропеолина (0,08 мг/мл) и 20 мкл раствора хитозана (100 мкг/мл). Смесь инкубировали 20 мин при 20°. После этого полученный комплекс титровали раствором ЛПС (200 мкг/мл), предварительно инкубированным при 37° в течение 48 ч, последовательно добавив порции по 5—10 мкл. Смесь выдерживали 2 (ЛПС-2, ЛПС-3) или 18 ч (R-ЛПС, ЛПС-1) при 37°. Поглощение определяли на спектрофотометре ^Quant Bio-TEK Instruments (INC, США) при длине волны 483 нм в трех параллельных пробах, из данных которых находили среднее арифметическое значение. Рассчитывали значение AD = Лэкс — D0, где D0 и Акс — поглощения растворов до и после прибавления ЛПС соответственно. Значения ADmax и Кс определяли из зависимости Скэтчарда в координатах AD/Cflnc от AD графическим методом. Из соотношения AD/ADmax определяли степень насыщения хитозана (Q) молекулами ЛПС.

Степень кооперативности (h) определяли из уравнения Хилла в логарифмической форме [17]:

lg(Q/1-Q) = h МСдпс] - lg[Kc].

Число участков связывания на молекуле эндотоксина, приходящееся на одну аминогруппу хитозана, оценивали из кривой насыщения, проводя касательную к точке, соответствующей максимальному изменению поглощения реакционной смеси. Затем определяли концентра-

цию ЛПС, соответствующую насыщению хито-зана эндотоксином.

Получение Х-НМ-сефарозы. К 4 мл сефаро-зы 4В, промытой водой, добавляли 2 мл раствора NaIO4 (15 мг/мл), смесь перемешивали в течение 60 мин, добавляли 0,1 мл этиленгликоля. Через 10 мин сефарозу промывали водой и к ней добавляли раствор Х-НМ (20 мг в 1 мл 0,001 М Na-карбонатного буфера, содержавшего 0,9%-ный NaCl (рН 8,0)). Смесь перемешивали в течение 24 ч, добавляли 60 мг NaBH4, выдерживали 1 ч и промывали гель водой на фильтре. Для определения количества связанного с сефарозой хито-зана 1 мл сорбента высушивали и гидролизовали концентрированной HCl (2 мл) в запаянной ампуле при 100° в течение 4 ч. Гидролизат фильтровали и упаривали. Количество свободного глю-козамина определяли методом Эльсона—Морга-на [18]. Количество глюкозамина, соответствующее количеству иммобилизованного хитозана, составило 1,2 мг на 1 мл сорбента.

Определение равновесных констант связывания [1251]-ЛПС-3 с иммобилизованным хитоза-ном. Х-НМ-Сефарозу отмывали 0,002 М фосфатным буфером (рН 5,0) и суспендировали в равном объеме этого буфера. К 0,05 мл Х-НМ-сефарозы (концентрация хитозана в реакционной смеси 0,002 М) добавляли различные объемы 0,001 М раствора [1251]-ЛПС (концентрация варьировала от 0,3 до 7 мМ). Объем среды доводили до 0,4 мл фосфатным буфером, смесь встряхивали в течение 4 ч при 37°, после чего центрифугировали. Осажденный сорбент промывали. Затем определяли радиоактивность связанного ЛПС на гамма-счетчике RIA-GAMMA (LKB, Швеция). Для определения неспецифической сорбции [1251]-ЛПС на Х-НМ-сефарозе связывание проводили в присутствии 100-кратного избытка немеченого гомологи

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком