МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2012, том 46, № 5, с. 766- 772
МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ КЛЕТКИ
УДК 577.2:616-006
ОПРЕДЕЛЕНИЕ мРНК РАКОВО-ТЕСТИКУЛЯРНЫХ ГЕНОВ В ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТКАХ, ЦИРКУЛИРУЮЩИХ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ КОЛОРЕКТАЛЬНЫМ РАКОМ, НА РАННИХ СТАДИЯХ ЗАБОЛЕВАНИЯ © 2012 г. Д. В. Новиков1*, Т. В. Белова1, Е. С. Плеханова1, О. С. Янченко2, В. В. Новиков1
Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и региональной экологии Нижегородского государственного университета им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, 603950 2Нижегородская государственная медицинская академия, Нижний Новгород, 603000
Поступила в редакцию 23.12.2011 г. Принята к печати 15.02.2012 г.
мРНК ряда раково-тестикулярных генов служат биомаркерами раковых клеток, мигрирующих по кровяному руслу. Нами проведено сравнение частоты обнаружения мРНК раково-тестикулярных генов MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, и 4, XAGE1 и MAGE-C1 в образцах опухолевых очагов (39) и периферической крови (64) больных колоректальным раком методом ОТ-ПЦР. В образцах опухолевых очагов мРНК хотя бы одного гена обнаруживается в 95% (37/39) случаев, тогда как в периферической крови — в 81% (52/64) случаев. Соответствующие мРНК детектировались в клеточной фракции периферической крови больных колоректальным раком на всех стадиях заболевания (в 14 из 14 случаев), тогда как во фракции внеклеточных нуклеиновых кислот плазмы обнаруживались только на стадиях III и IV. Наши данные указывают на возможность ранней диагностики колоректального рака в группах пациентов высокого риска с использованием периферической крови.
Ключевые слова: мРНК раково-тестикулярных генов, ОТ-ПЦР, колоректальным рак, циркулирующие раковые клетки.
EARLY DETECTION OF CANCER/TESTIS mRNAs IN TUMOR CELLS CIRCULATING IN THE PERIPHERAL BLOOD OF COLORECTAL CANCER PATIENTS, by D. V. Novikov1*, T. V. Belova1, E. S. Plekhanova1, O. S. Yanchenko2, V. V. Novikov1 (institute of Molecular Biology and Regional Ecology, Lobachevsky State University of Nizhni Novgorod, Nizhni Novgorod, 603950 Russia, *e-mail: mbre@mail.ru; 2Nizhny Novgorod State Medical Academy, Nizhni Novgorod, 603000). Recent studies have suggested that mRNAs transcribed from cancer/testis genes might be used as biomarkers of cancer cells migrating through the bloodstream. Using RT-PCR we evaluated the expression of several cancer/testis mRNAs (MAGEA1-6, GAGE1-8, NY-ESO-1, SSX1, 2, and 4, XAGE1 and MAGEC1) in primary tumors and peripheral blood samples of colorectal cancer patients. The detection rate of at least one of the transcripts was 95% (37/39 samples) for primary tumors and 81% (52/64 samples) for the peripheral blood. Moreover, selected mRNAs were detectable in cellular fraction of the peripheral blood at all stages the disease (14 out of 14 cases), whereas in extracellular fraction of plasma were found only at stages III and IV. Obtained data open a possibility of early diagnosis of colorectal cancer in people at high risk by peripheral blood analysis.
Keywords: cancer/testis mRNA, RT-PCR, colorectal cancer, circulating cancer cells.
Процесс образования метастазов включает перемещение с током крови раковых клеток от первичной опухоли в отдаленные органы [1]. Исследования показали присутствие циркулирующих опухолевых клеток в периферической крови больных онкологическими заболеваниями. В настоящее время обсуждается, каким образом наличие в
* Эл. почта: dv_novikov@yahoo.com
периферической крови циркулирующих опухолевых клеток может быть использовано в прогностических и мониторинговых целях. Основной проблемой является низкая частота обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, вызванная применением методов, основанных на использовании недостаточно специфичных онкомар-керов [2].
Известна группа раково-тестикулярных (СТ — от английского сапсегДе8И8) генов, характеризующаяся ограниченной экспрессией в клетках человека. В группу СТ-генов отнесены около 70 семейств генов, большинство из которых расположены на Х-хромосоме в виде мультигенных семейств [3]. СТ-гены транскрибируются в семенниках, клетках зародыша и плаценты, иногда в клетках иммунопривилегированных тканей. В остальных клетках экспрессия СТ-генов подавлена эпигенетически. Функции большинства СТ-белков не известны, однако установлена принадлежность некоторых белков к группе транскрипционных факторов [4]. В зародышевых клетках экспрессия СТ-генов ассоциирована с клетками, обладающими высокой пролифера-тивной активностью [5]. При трансформации клетки в опухолевую наблюдается активация экспрессии СТ-генов, что связано с метилированием хромосомной ДНК [6]. Исследования содержания мРНК СТ-генов в клетках различных типов опухолей указывают на случайный характер активации. Клетки опухоли, сходные по гистологическому типу и локализации, могут иметь отличающиеся наборы активных СТ-генов, а опухоли, имеющие разное тканевое происхождение, могут обладать сходным набором раково-тестикуляр-ных мРНК. Предполагается, что экспрессия СТ-генов связана с приобретением опухолевыми клетками таких свойств, как способность к активной пролиферации и миграции в отдаленные органы и ткани [3].
Хотя экспрессия СТ-генов незначительна, ее уровень достаточен, чтобы использовать их мРНК в качестве маркеров опухолевых клеток при различных онкологических заболеваниях. Показано, что мРНК СТ-генов обнаруживаются не только в клетках опухолевых очагов, но и в периферической крови больных. Однако остается не ясным, отражением какого процесса является обнаружение мРНК СТ-генов в периферической крови. В общем, это следствие значительных изменений в программе дифференцировки в результате реорганизации структуры хроматина и системы регуляции транскрипции кодирующих и некодирую-щих РНК. Конкретные процессы, обусловливающие изменения в экспрессии большинства генов не ясны. Предполагается, что присутствие мРНК СТ-генов в периферической крови свидетельствует о наличии циркулирующих опухолевых клеток [7]. С другой стороны, известно, что в периферической крови обнаруживаются внеклеточные нуклеиновые кислоты, в том числе мРНК, находящаяся в составе нуклеопротеидных комплексов разной природы [8]. Результаты настоящей работы свидетельствуют о том, что присутствие мРНК СТ-ге-нов в периферической крови больных колорек-тальным раком на ранних стадиях заболевания
является показателем циркуляции опухолевых клеток.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
В работе использовали следующие нуклеотид-ные последовательности mRNA, зарегистрированные и обозначенные в базе данных GenBank: Homo sapiens (далее Hs) G antigen 1 (GAGE1), NM_001468; Hs G antigen 2 (GAGE2), NM_001472; Hs G antigen 3 (GAGE3), NM_001473; Hs G antigen
4 (GAGE4), NM_001474; Hs G antigen 5 (GAGE5), NM_001475; Hs G antigen 6 (GAGE6), NM_001476; Hs G antigen 7 (GAGE7), NM_021123; Hs G antigen 8 (GAGE8), NM_012196; Hs G antigen, family D, 2 (XAGE1), NM_020411; Hs autoimmunogenic can-cer/testis antigen NY-ESO-1, U87459; Hs melanoma antigen family C, 1 (MAGEC1), NM_005462 и XM_936930; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 1 (SSX1), NM_005635 XM; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 2 (SSX2), transcript variant 1, NM_003147; Hs synovial sarcoma, X breakpoint 4 (SSX4), transcript variant 1, NM_005636; Hs melanoma antigen family A, 1 (MAGEA1), NM_004988; Hs melanoma antigen family A, 2 (MAGEA2), NM_153488; Hs melanoma antigen family A, 3 (MAGEA3), NM_005362; Hs melanoma antigen family A, 4 (MAGEA4), NM_001011548; Hs melanoma antigen family A,
5 (MAGEA5), NM_021049; Hs melanoma antigen family A, 6 (MAGEA6), NM_005363. Анализ нук-леотидных последовательностей проводили с использованием ресурсов, доступных в интернет на портале NCBI, и компьютерной программы MEGA3.1.
Исследовали образцы периферической крови больных колоректальным раком, взятой до хирургического вмешательства, и образцы из опухолевых очагов после резекции опухоли у тех же больных. Все образцы получены от больных, проходивших лечение в Нижегородском областном онкологическом центре. В качестве отрицательного контроля использовали периферическую кровь 20 добровольцев. Для разрушения клеток и предотвращения деградации мРНК все тестируемые образцы помещали в равный объем лизирую-щего буфера, содержащего 4М гуанидинтиоциа-нат, 0.5% Тритона-X-100 и 25 мМ ацетат натрия, рН 7.0.
Выделяли нуклеиновые кислоты из 200 мкл исследуемых образцов, используя метод депротеини-зации смесью фенола и хлороформа с последующей преципитацией этанолом [9]. Затем проводили реакцию обратной транскрипции с использованием обратной транскриптазы M-MuLV ("Fermentas ЕС"), согласно рекомендациям производителя. В качестве затравки применяли смесь олигонук-леотидов, специфичных для мРНК MAGEA1-6, GAGE1-9, NY-ESO-1, SSX1, 2 и 4, XAGE1 и MAGEC1, обозначенных R1 (табл. 1). Получен-
Таблица 1. Характеристика праймеров, используемых для обнаружения мРНК СТ-генов методом ОТ-ПЦР
мРНК Этап ПЦР Название Первичная структура (5'- 3') Размер кДНК (п.н.)
MAGEA1-6 I MMRP1 [10] ACTGAAGGAGAAGATCTGCC 375
MAR1 GTGCTTGGCCCCTCCTCTTC
II MAF2 AGGAGAAGATCTGCCWGTGG 265
MAR2 CTGGAGGCTCCCTGAGGACT
SSX1, 2, 4 I SSXF1 GAGAAGTTCCGAAAGGCCTT 289
SSXR1 TTCTTGGGCATGATCTTCGGG
II SSXF2 AGGTTATGACTAAACTAGGT 129
SSXR2 AAGTCATCTGAGGACGTTCA
XAGE1 I X-F1 CTACTGAGACACGGCGGACA 329
X-R1 TTGTTTCAGCTTGTCTTCAT
II X-F2 ATACAGCTGAGATCCCAGTG 162
X-R2 TTGTGGTTGCTCTTCACCTG
MAGEC1 I C-F1 CCTATCCAGTCTTCAAGGTG 297
C-R1 CAGGACAACTCTGAGGACTC
II C-F2 AGTGCCAGGAGTCAAGGTTC 138
C-R2 GCATATCCTTGTCCCCCATG
NY-ESO-1 I NYF1 AGAGCCGCCTGCTTGAGTTC 172
NYR1 TCTGCAGCAGTCAGTCGGAT
II NYF2 CCTGCTTGAGTTCTACCTCG 159
NYR2 GCAGTCAGTCGGATAGTCAG
GAGE1-8 I G-F1 ATTGGGCCTATGCGGCCCGA 321
G-R1 TCCAACAYAGGAGCAGCCTG
II G-F2 AGCATCTGCAGSTCAAGGGC 170
G-R2 TCTTTTAACACTGTGATTGC
ные образцы кДНК амплифицировали, используя метод ПЦР в два раунда для раздельного выявления мРНК каждого из (шести семейств) исследуемых генов (табл. 1). В реакционной смеси содержалось 85 мМ ацетат калия, 25 мМ трицин, рН 8.7, 8% глицерина, 1.5 мМ MgCl, по 0.2 мМ каждого из dNTP, по 10 пикомоль праймеров R
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.