научная статья по теме ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА У ДЕСЯТИ ВИДОВ ЖУРАВЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ДНК-МАРКЕРА ЕЕ0.6 Биология

Текст научной статьи на тему «ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА У ДЕСЯТИ ВИДОВ ЖУРАВЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ДНК-МАРКЕРА ЕЕ0.6»

ГЕНЕТИКА, 2013, том 49, № 12, с. 1436-1439

КРАТКИЕ СООБЩЕНИЯ =

УДК 575.18:598.322

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА У ДЕСЯТИ ВИДОВ ЖУРАВЛЕЙ С ПОМОЩЬЮ ДНК-МАРКЕРА ЕЕ0.6

© 2013 г. Е. А. Мудрик1, Т. А. Кашенцева2, Е. А. Гамбург1, Д. В. Политов1

Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова Российской академии наук, Москва 119991

e-mail: mudrik@vigg.ru

2Питомникредких видов журавлей, Окский государственный природный биосферный заповедник,

Рязанская область, пос. Брыкин Бор 391072 Поступила в редакцию 29.04.2013 г.

С помощью уникальной ДНК-последовательности W-хромосомы EE0.6 проведено молекулярное определение пола у 383 особей десяти видов журавлей (Grusgrus L., G. leucogeranus Pallas, G. japonensis Muller, G. vipio Pallas, G. canadensis L., G. antigone L., G. monacha Temminck, Anthropoides virgo L., Balearica regulorum Bennett и B. pavonia L.), содержащихся в зоопарках и других центрах искусственного разведения. У 211 птиц половой диагноз был установлен или уточнен впервые. Показана эффективность применения маркера пола EE0.6 для птенцов, неполовозрелых и взрослых журавлей разных видов, а также межвидовых гибридов.

DOI: 10.7868/S0016675813120060

Половая идентификация журавлей (Gruidae: Gruiformes: Aves), не обладающих выраженным внешним половым диморфизмом, важна как для изучения популяционной биологии этих птиц в природе, так и для организации репродуктивных программ в центрах разведения. В России обитают семь из 15 современных видов журавлей: серый, Grus grus (Linnaeus, 1758); японский, Grus japonensis (P.L.S. Muller, 1776); даурский, Grus vipio Pallas, 1811; черный, Grus monacha Temminck, 1836; канадский, Grus canadensis (Linnaeus, 1758); стерх, Grus leucogeranus Pallas, 1811 и журавль-красавка, Anthropoides virgo (Linnaeus, 1758). Для стерха, японского и даурского журавлей — редких видов российской и мировой орнитофауны, охраняемых национальным и международным законодательствами, — осуществляются программы искусственного разведения с последующей реинтро-дукцией птенцов [1]. Другие виды журавлей, включая экзотические, также содержатся и размножаются в зоопарках и/или центрах разведения [2].

Одним из наиболее распространенных молекулярных маркеров пола у птиц является сцепленный с полом ген хромохеликазы (chromo-heli-case DNA binding protein 1, CHD1) [3, 4]. Принцип применения CHD1 состоит в том, что из-за различий в размерах интрона этого гена на половых W-и Z-хромосомах птиц в полимеразной цепной реакции (ПЦР) у самок и самцов амплифицируются фрагменты ДНК разной длины. Вследствие этого электрофоретический спектр продуктов ПЦР у гомогаметных (ZZ) самцов однополосный, а у ге-терогаметных (WZ) самок — двухполосный. Одна-

ко данный маркер пола для птиц не стал универсальным из-за случаев амплификации ПЦР-про-дуктов одинакового размера у самок и самцов [5, 6] и разной длины у самцов [5, 7], множественности [5] и полного отсутствия амплификата у обоих полов [8]. Отдельной проблемой применения CHD1 у некоторых видов оказался близкий размер "мужских" и "женских" полос с незначительной разницей в 2—8 пар нуклеотидов (пн), которую трудно определить при электрофорезе [9]. Определение пола у журавлей с помощью маркера CHD1 проводится с достаточно высокой точностью [10], однако также нуждается в оптимизации для каждого вида. В частности, для венценосного журавля отмечена незначительная разница в длинах фрагментов этого гена у разных полов [11].

Почти одновременно с открытием гена хромо-хеликазы японскими учеными Огавой с соавт. [12, 13] в качестве маркера пола была предложена уникальная последовательность W-хромосомы EE0.6 (фрагмент EcoRI размером 0.6 тпн), консервативная у всех килевых и бескилевых птиц. В отличие от маркера CHD1 праймеры последовательности EE0.6 не затрагивают изменчивый ин-трон, поэтому размер W-специфичного фрагмента у самок фиксирован. Кроме того, общий для обоих полов Z/W внутренний контроль является частью экзона сцепленного с полом гена [14]. Комбинируя шесть праймеров, фланкирующих последовательность EE0.6, можно диагностировать пол у любых видов птиц [12]. Для определения пола семи видов журавлей в Китае (стерха, японского, даурского, серого, черного, черно-шейного (Grus nigricollis (Przewalski, 1876) и журав-

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПОЛА У ДЕСЯТИ ВИДОВ ЖУРАВЛЕЙ

1437

ля-красавки) Бао с соавт. [15] использовали четыре праймера EE0.6 в трех комбинациях.

Целью нашей работы было определение пола у десяти видов журавлей (серого, японского, даурского, черного, канадского, стерха, журавля-красавки, а также индийского (Grus antigone (Linnaeus, 1758)), восточного (Balearica regulorum (Bennett, 1834)) и западного (B. pavonia (Linnaeus, 1758)) венценосных журавлей) с помощью последовательности EE0.6 в качестве маркера пола и выбор наиболее оптимального сочетания праймеров для определения пола у птенцов, неполовозрелых птиц, взрослых журавлей с неясным половым поведением и особей гибридного происхождения.

Для установления пола взрослых птиц в качестве источника ДНК использовали в основном кровь, взятую из локтевой вены крыла в ходе ежегодных плановых диспансеризаций журавлей в 2010—2012 гг. и некоторые предыдущие годы, консервированную в ЭДТА или засушенную на фильтровальной бумаге. В редких случаях источником для выделения ДНК был эпидермис очи-нов некрупных (до 10 см) перьев. Для определения пола птенцов по возможности использовали капилляры аллантоиса подскорлуповых оболочек яиц (если их не съедали родители-журавли после вылупления птенцов), в остальных случаях — растущие (кровяные) перья и редко — кровь. Для выделения ДНК из разных тканей брали следующее количество материала: 1—2 мкл крови, срезы очи-нов пера размером 2 х 3 мм, фрагменты капилляров аллантоиса длиной 2—3 мм. Экстракцию ДНК проводили разными способами: с помощью ионообменной смолы Chelex-100 [16], наборами для выделения ДНК из животных тканей DIAtom™ DNAPrep100 (ООО "Лаборатория Изоген") и DiamondDNA Animal tissue Kit.

Последовательности праймеров A — (AWS05/NRD4: 5 ' - CACCCTGGATTGGACAAC-CTATTTC-3'; 5'-TCAGAGCACTCTTTCCAGGAA-3'), B - (SINT-F/SINT-R: 5'-TAGGCTGCAGAA-TACAGCAT-3'; 5'-TTGTGCAGTTCTAGTCCATA-3'), C - (USP1/USP3: 5'-CTATGCCTACCACMTTC-CTATTTGC- 3' ; 5 ' -AGCTGGAYTTCAGWSCA-TCTTCT-3'), D - (CPE15F/CPE15R: 5'-AAGCATA-GAAACAATG-TGGGAC-3'; 5'-AACTCTGTCTG-GAAGGACTT-3') и условия их амплификации были взяты из статьи Бао с соавт. [15]. Праймеры использовали в комбинациях АВ, ВС и CD. Сборку ПЦР осуществляли с помощью набора реагентов GenPak PCR Core (OOO "Лаборатория Изоген") согласно рекомендациям производителя. Профиль ПЦР включал следующие этапы: первичная денатурация при 94°С — 5 мин, далее 30 циклов, включающих денатурацию при 94°С — 50 с, отжиг праймеров при 57°С — 50 с, элонгацию при 72°С - 50 с, и завершающая элонгация при 72°С -10 мин. Для проведения ПЦР использовали

а

-300

-150

Электрофореграммы с продуктами амплификации маркера пола ЕЕ0.6. а — пример спектров самца и самки стерха по трем комбинациям праймеров: 1 — самец, AB; 2 — самка, АВ; 3 — самец, BC; 4 — самка, ВС; 5 — самец, CD; 6 — самка, CD. б — пример определения пола у разных видов журавлей по комбинации праймеров АВ: 1, 2 — серый журавль, 5 , 5; 3 — даурский журавль, 5 ; 4, 5 — японский журавль, 5 , 5 ; 6, 7 — восточный венценосный журавль, 5 , &; 8 — журавль-красавка, 5 . Справа даны размеры фрагментов в парах нуклеотидов. M — маркер длин фрагментов.

ДНК-амплификатор Dyad Peltier Thermal Cycler (BioRad). Электрофорез продуктов амплификации осуществляли в 1.5%-ном агарозном геле (буферная система TAE) при напряжении 120 В с последующим окрашиванием геля бромистым эти-дием и визуализацией в ультрафиолетовом свете с помощью системы гель-документации Kodak Edas 290. В качестве маркера длин фрагментов при электрофорезе использовали 1 Kb ДНК-маркер ("Сибэнзим").

За период 2010—2012 гг. нами было проанализировано 383 особи десяти видов журавлей (включая три межвидовых гибрида) из 31 зоопарка и/или центра разведения (таблица). Среди этих птиц были особи с известным полом (как правило, размножающиеся пары), а также птенцы разного возраста, молодые птицы, взрослые журавли с невыраженным половым поведением, а также три гибрида: две птицы от скрещивания самок даурского журавля со стерхом и одна птица от скрещивания самки стерха с серым журавлем. Гибридные особи были получены в результате искусственного осеменения в Питомнике редких видов журавлей Окского государственного природного биосферного заповедника, и для двух из них пол был неизвестен.

У представителей десяти видов журавлей с известным полом (включая виды, для которых маркер ЕЕ0.6 применялся нами впервые — канадский и индийский журавли, западный и восточный венценосные журавли) электрофоретические спектры самцов были однополосными, для самок — двухполосными по каждой из комбинаций праймеров (рисунок, а). Длины W-специфичных фрагментов у самок журавлей всех видов составили 300 (в соче-

Мрц tiS втш /370 ^=1 300 — 250

ш * ШЯЯ ш ■■■ 1 2 3 4 5 6 М ч150

flflMÉ шлм тят ШЁЛ ШЯШ •м ШШ (М

12 3 М 4 5 6 7 8

1438

МУДРИК и др.

Виды журавлей и количество особей, у которых определяли пол с помощью маркера ЕЕ0.6 и для которых был впервые установлен или уточнен половой статус

Вид Общее количество птиц Комбинация праймеров Количество птиц, для которых впервые установлен пол

всего самцы самки

Стерх 107 AB 38 22 16

Японский журавль 76 AB 28 12 16

Серый журавль 57 AB 47 21 26

Журавль-красавка 54 AB, BC, CD 48 26 22

Даурский журавль 52 AB 26 8 18

Восточный венценосный журавль 21 AB 18 11 7

Западный венценосный журавль 5 AB 3 2 1

Канадский журавль 4 AB 0 0 0

Индийский журавль 3 AB 0 0 0

Черный журавль 1 AB 1 1 0

Гибрид стерха и серого журавля 1 AB 0 0 0

Гибрид даурского журавля и стерха 2 AB 2 1 1

Всего 383 211 104 107

тании праймеров АВ) и 370 (ВС, СЭ) пн; общих 2/^фрагментов - 150 (АВ, ВС) и 250 (СЭ) пн.

Для определения пола у большинства видов журавлей (за исключением журавля-красавки) достаточной и наиболее оптимальной из трех оказалась комбинация праймеров АВ (рисунок, б). При ее использовании амплифицируются сам

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком