МЕТОДИКА
581.1
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ САЛИЦИЛОВОЙ КИСЛОТЫ В КОРЕ И ВЕТКАХ ИВЫ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
© 2007 г. И. Петрек*, Л. Гавел*, И. Петрлова**, В. Адам ** ***, Д. Потесил **' ***, П. Бабула****, Р. Кизек**
*Отдел биологии растений агрономического факультета Университета сельского и лесного хозяйства им. Менделя, Брно, Чехия
**Отдел химии и биохимии агрономического факультета Университета сельского и лесного хозяйства им. Менделя, Брно, Чехия ***Отдел аналитической химии научного факультета Университета им. Мазарика, Брно, Чехия ****Отдел природных лекарственных средств Университета ветеринарии и фармацевтики, Брно, Чехия Поступила в редакцию 20.02.2006 г.
Усовершенствован электрохимический метод измерения содержания свободной салициловой кислоты (CK). Лучшие результаты были получены методом квадратно-волновой вольтамперометрии (КВВ) с использованием карандашного графитового электрода. Чувствительность метода составляла 1.7 нг/мл. КВВ использовали для определения содержания CK в коре и ветках растений 13 видов ивы (Salix L.). Самое высокое содержание свободной CK найдено в коре S. laponum (3.0 мг/г сырого веса), а также в ветках S. purpurea сорта Nana (2.1 мг/г сырого веса) и S. planifolia (2.2 мг/г сырого веса). Содержание свободной CK в иве сорта Aegma Brno, выращенной в Брно, было низким (в ветках нашли 129 мкг/г сырого веса). Метод КВВ, использованный для определения содержания CK в тканях ивы, характеризуется гораздо более широким диапазоном определяемых концентраций и большей чувствительностью по сравнению с методами линейной развертки и циклической вольт-амперометрии из-за дискриминации емкостного тока.
Salix sp. - салициловая кислота - электрохимический метод - квадратно-волновая и циклическая вольтамперометрия
ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 623-628
УДК
ВВЕДЕНИЕ
Салициловая, или 2-оксибензойная, кислота (СК) играет важную сигнальную роль в активации различных защитных реакций при атаке патогенов. Эти реакции включают индукцию локальной и системной устойчивости, стимуляцию гибели клеток хозяина и ограничение распространения патогена [1, 2]. Имеются данные об изменении содержания СК в растениях при стрессе [3, 4]. Кроме того, СК является эндогенным регулятором роста растений, выполняющим многочисленные функции при нормальных условиях [5].
Для определения содержания СК и ее производных предложен ряд аналитических подходов.
Сокращения: СК - салициловая кислота; ЦВ - циклическая вольтамперометрия; КВВ - квадратно-волновая вольтамперометрия.
Адрес для корреспонденции: R. Kizek. Department of Chemistry and Biochemistry, Faculty of Agronomy, Mendel University of Agriculture and Forestry, Zemedelska 1, CZ-61300, Brno, Czech Republic. Fax: +420-5-4521-1128; e-mail: kizek@sci.muni.cz
Например, для других объектов использовали УФ-спектрометрию, спектрофлуорометрию, метод инжекции потока, а для растений - ВЭЖХ с различными детекторами [6-9]. В некоторых случаях для определения салицилатов и других фе-нольных соединений использовали их электрохимические свойства [10-15]. Из широкого спектра электрохимических методов для определения СК ранее применяли только дифференциально-импульсную вольтамперометрию [12, 15]. Мы использовали другой электрохимический метод определения СК - квадратно-волновую вольтамперометрию (КВВ). Метод был усовершенствован и применен для определения содержания свободной СК в коре и ветвях растений 13 наиболее широко распространенных видов Salix.
МЕТОДИКА
Растительный материал. В июле 2005 г. в Ботаническом саду Университета сельского и лесного хозяйства им. Менделя (Брно) брали пробы коры и 2-летних побегов ивы (Salix L.). Анализи-
ровали образцы 13 видов растений: S. laponum, S. planifolia, S. foetida, S. foetida X S. hastata, Salix сорта Aegma Brno (S. aegyptica X S. magnifica), S. purpurea сорт Nana, S. reinii, S. repens, S. eryth-rotoflexuosa, S. caterii, S. fragilis, S. triandra и S. vim-inalis. Возраст деревьев варьировал от 5 до 40 лет. Образцы (0.5-2.0 г) помещали в полиэтиленовые емкости, содержавшие 15 мл 99.99%-ного метанола, и гомогенизировали в аппарате "Vortex-2 Genie" ("Scientific Industries", США) со скоростью 400 об./мин в течение 72 ч при 4°С [9]. Выбор объемов образцов для определения СК приведен в разделе РЕЗУЛЬТАТЫ.
Приготовление растворов СК. Исходные растворы содержали 50 мг СК/мл метанола. Растворы хранили в темноте при -20°С. Рабочие растворы для определения готовили ежедневно путем разбавления исходного раствора. Значения рН измеряли на рН-метре ("MultiLab Pilot", Германия) под контролем компьютерной программы MultiLab Pilot. Все реактивы получены от фирмы "Sigma-Aldrich" (США).
Электрохимическое измерение. Электрохимический анализ чистого препарата СК и экстрактов из тканей ивы проводили с использованием анализатора AUTOlAb ("EcoChemie", Нидерланды) при комнатной температуре. Первоначальные данные обрабатывали с использованием фильтра Savitzky-Golay (уровень 2) и с коррекцией средней базовой линии (GPES, ширина пика 0.03). В качестве электролита использовали буфер Бриттон-Робинсона (рН 1.81), содержавший 0.4 М H3PO4, 0.4 M CH3COOH, 0.4 M H3BO3; рН подводили 0.2 М NaOH.
Циклическая вольтамперометрия (ЦВ). Трех-электродная система включала рабочий электрод с углеродной пастой, электрод сравнения (Ag/AgCl/3 M KCl) и угольный вспомогательный электрод. Параметры ЦВ: начальный потенциал - 0 В, максимальный потенциал - 1.2 В, конечный потенциал - 0 В, шаговые изменения потенциала - 5 мВ.
Квадратно-волновая вольтамперометрия (КВВ).
Трехэлектродная система состояла из карандашного графитового стержня в качестве рабочего электрода, электрода сравнения (Ag/AgCl/3 M KCl) и углеродного вспомогательного электрода. Параметры КВВ: начальный потенциал - 0.7 В, конечный потенциал - 1.5 В, частота - 260 Гц, амплитуда - 50 мВ, шаг изменения потенциала -10 мВ.
Приготовление дискового электрода с углеродной пастой. Углеродная паста (около 0.5 г) состояла из 70% графитового порошка ("Sigma-Ald-rich") и 30% минерального масла той же фирмы, не содержавшего ДНКазы, РНКазы и протеазы [16, 17]. Пасту помещали в тефлоновый корпус, диаметр дисков был равен 2.5 мм. Перед измере-
ниями поверхность электрода регенерировали, протирая мягкой фильтровальной бумагой. Объем образца составлял 5 мкл.
Приготовление электрода с графитовым стержнем. Графитовые стержни для карандашей диаметром 500 мкм и длиной 60 мм получали от фирмы "Kohinor" (Чехия). Помещая кончик карандашного стержня длиной 3 мм в раствор, получали электрод с активной поверхностью 4.91 мм2. Электроды использовали без особой предобработки, но механически полировали пастой окиси алюминия с размером зерен 0.1 мкм ("ESA Inc.", США) [18]. Применение графитового электрода в качестве рабочего электрода описано также в работах [19, 20].
Чувствительность, точность и выход СК определяли в гомогенатах коры и ветвей S. purpurea сорта Nana путем сравнения со стандартным раствором [21]. Перед экстракцией в образцы тканей ивы добавляли 100 мкл стандартного раствора СК или 100 мкл воды. За порог чувствительности метода принимали концентрацию СК, трехкратно превышавшую нулевой уровень, но более надежным считали 10-кратное превышение фона. Точность (коэффициент вариации) результатов проверяли измерениями в течение дня и в разные дни. Для этого 6 гомогенатов анализировали в течение 5 дней, в промежутках образцы хранили при -20°С в темноте. Образцы брали случайным образом, концентрации СК рассчитывали по калибровочной кривой. О точности измерений судили, сравнивая определяемую и заранее известную концентрации СК. Указанные характеристики метода были получены в соответствии с рекомендациями [21].
РЕЗУЛЬТАТЫ
При определении содержания СК, прежде всего, изучили основные электрохимические характеристики самой СК и ее производных, действие которых может накладываться на определение СК. Для этого применили метод ЦВ, основанный на электрохимических свойствах соединений [22, 23]. На рис. 1а представлена вольтамперограмма СК, полученная при разных скоростях развертки налагаемого потенциала (25, 50, 75, 100 и 125 мВ/с). Можно видеть, что сигнал СК регистрировался при потенциале 1.09 В и увеличивался с повышением концентрации СК и скорости развертки (рис. 26).
Поскольку СК имеет много производных, было важно изучить, может ли их присутствие влиять на электрохимическое определение СК. Изучили 4 производных СК: тиосалициловую, асе-тилсалициловую, 5-сульфосалициловую и 3,5-динитросалициловую кислоты. Ацетилсалициловая и 3,5-сульфосалициловая кислоты не давали
Циклическая вольтамерометрия
Потенциал, В Скорость развертки, мВ/с
Рис. 1. Циклические вольтамперограммы и влияние разных концентраций СК и скоростей развертки на высоту пиков. а - вольтамперограммы при концентрации СК, равной 100 мкг/мл, измеренные при разных скоростях развертки потенциала: 1 - 25, 2 - 50, 3 - 75, 4 - 100, 5 - 125 мВ/с; б - концентрации СК: 1 - 25, 2 - 50, 3 - 100 мкг/мл.
электрохимического сигнала (табл. 1), тогда как сигналы тиосалициловой и 5-сульфосалициловой кислот были обнаружены при потенциалах 0.70 и 1.15 В соответственно. Таким образом, электрическая активность салицилатов непосредственно зависит от природы связанной с СК группы. Только серозамещенная СК давала электрохимический сигнал, однако величина пиков была много ниже, чем величина сигнала от незамещенной СК. Различия в высоте пиков и величине потенциалов, при которых генерируются сигналы, достаточно велики, чтобы можно было отличить сигналы СК от сигналов ее производных.
Так как ЦВ оказалась недостаточно чувствительна при определении СК в биологических объектах, мы попытались определить СК другим методом - методом КВВ, используя карандашный графитовый электрод диаметром 500 мкм, и показали, что при потенциале 1 В СК давала хорошо определяемый сигнал (рис. 26). При концентрациях СК выше предела чувствительности метода, равного 1.7 нг/мл, высота сигнала была пропорциональна концентрации СК (рис. 26).
В проведенных экспериментах СК экстрагировали из тканей метанолом. Но органические
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.