УСПЕХИ ФИЗИОЛОГИЧЕСКИХ НАУК, 2015, том 46, № 2, с. 17-23
УДК 577. 3; 612.821.73
ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ ПОДХОД К ИССЛЕДОВАНИЮ ЦЕНТРАЛЬНЫХ МЕХАНИЗМОВ РЕГУЛЯЦИИ ПОВЕДЕНИЯ
© 2015 г. Н. Н. Дыгало
Институт цитологии и генетики СО РАН, Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск
Создание методов селективного управления активностью нейронов при помощи света - оптогене-тики, стало важным достижением последнего времени, существенно расширившим возможности современной нейробиологии. В обзоре представлена общая концепция оптогенетики и обсуждены недавние результаты и перспективы применения этого подхода в психоповеденческих исследованиях.
Ключевые слова: оптогенетика, фоточувствительные белки, активность нейронов, поведение, депрессия, тревожность
Идея использовать свет для управления активностью клетки возникла еще в прошлом веке [12] и примерно в то же время у некоторых микроорганизмов были выявлены реагирующие на свет белки: бактериородопсин (ЪайегюгЬодорзт) [24], галородопсин (Иа^гИодорзт) [22] и, в дальнейшем, ченнелродопсин (сИаппекИодорзт) [23]. В 2005 г. была создана первая однокомпонентная система, способная при помощи света изменять активность нейрона [5], а в 2006 г. был предложен термин "Оптогенетика" (Ор1^епе1;1с8). К настоящему времени в этой новой области нейробио-логических исследований опубликованы сотни статей, охватывающих широкий спектр функций нейронов и их сетей у самых разнообразных объектов от нематоды, плодовой мушки и аквариумной рыбки до лабораторных грызунов и даже приматов [8, 9, 34]. Данный обзор не претендует на полный анализ этой уже весьма обширной области и нацелен лишь на краткое представление общей концепции оптогенетики и обсуждение перспектив применения этого подхода в психоповеденческих исследованиях.
ОСНОВЫ ОПТОГЕНЕТИЧЕСКОГО МЕТОДА
Суть оптогенетического подхода состоит в активации светом внедренных в клеточную мембрану планируемых к исследованию нейронов модифицированных генно-инженерными мето-
дами светочувствительных ионных каналов - оп-синов [28, 34]. Эти светочувствительные каналы реагируют на свет определенной длины волны: ченнелродопсин активируется голубым светом, деполяризует мембрану и активирует нейроны, в то время как галородопсин активируется желтым светом, гиперполяризует мембрану и ингибирует активность нейронов (см. рисунок).
Для обеспечения экспрессии опсина в желаемом типе клеток; фрагмент ДНК, содержащий специфический для этих клеток промотор, соединяется с геном опсина, и полученная конструкция упаковывается в вирус. Этим вирусом, путем его введения в целевой регион мозга, инфицируют или трансдуцируют все восприимчивые клетки, однако, благодаря промотору, вирус успешно продуцирует опсин только в нейронах-мишенях, а не в соседних клетках других типов [2]. В настоящее время созданы разнообразные вирусные векторы, способные обеспечить экспрессию светочувствительного канала в желаемом типе клеток за счет тканеспецифичного промотора непосредственно вирусной матрицы. Однако следует отметить, что идентифицировать промоторные фрагменты ДНК, специфичные и при этом достаточно компактные, чтобы их можно было эффективно упаковать в пределах вирусной частицы, удается не для всех типов клеток.
Более универсальный подход основан на использовании трансгенных мышей, у которых фермент Сге-рекомбиназа экспрессируется только в
Ченнелродопсин Галородопсин 589 нм
Трансфекция | клеток мозга Вирус
Фоточувствительный нейрон
^^Транскрипция ^ / СУ\
Трансляциям*^
Встраивание канала в мембрану клетки
Лазер-.Фотодиод
Основные элементы оптогенетического исследования. А. Фо-торецепторные каналы: ченнелродопсин активируется голубым светом, деполяризует мембрану и активирует нейроны, галородопсин активируется желтым светом, гиперполяризует мембрану и ингибирует активность нейронов. Б. Придание фоточувствительности нейрону. Модифицированный ген канала упаковывается в вирусные частицы, которыми трансфецируются клетки мозга. Экспрессия (траскрипция, трансляция и встраивание в мембрану клетки) белка канала придает нейрону чувствительность к фотонам той длины волны, которая активирует канал. В. Подведение к фоточувствительному нейрону по оптоволокну света лазера или фотодиода повысит или понизит, в зависимости от типа оп-сина и фотонов соответствующей длины волны, активность нейрона и изменит регулируемые нейроном функции и/или поведение животного (пояснения в тексте).
целевых клетках [21]. В этом случае нет необходимости присутствия ДНК, придающей специфичность экспрессии в определенном типе клеток, в пределах вирусной частицы, что позволяет с большей специфичностью нацеливать экспрессию опсина. При введении в мозг разработанных и созданных Сге-зависимых вирусов, несущих ген фоточувствительного белка, экспрессия этого белка будет происходить только в целевых (Сге-экспрессирующих) клетках. Уже имеются трансгенные животные, экспрессирующие Сге-рекомбиназу в разнообразных специфических типах клеток. После введения таким животным вируса, содержащего кондиционный аллель гена канала, экспрессия которого блокирована последовательностью нуклеотидов, фланкированной
двумя /охР-сайтами, Cre-lox-система удалит блокирующую последовательность и, тем самым, обеспечит экспрессию фоточувствительного белка, привнесенного в клетку вирусом, лишь в конкретном типе клеток. Такой подход обеспечил возможность контроля активности определенных популяций нейронов в мозге мышей в условиях свободного поведения. Это было осуществлено, например, при исследовании поведенческих проявлений реакций вознаграждения и обусловливания в отношении дофаминергических нейронов вентральной покрышки, благодаря избирательной экспрессии опсина под промотором гена ключевого фермента синтеза нейротрансмиттера этих нейронов - тирозингидроксилазы [20, 27]. Подобный подход был реализован и для крыс в результате создания линий этих животных, несущих Сге-драйвер [33]. Для исследований in vivo вирус вводится в область мозга, функцию клеток которой предстоит исследовать, и канал активируется светом необходимой длины волны, который подается через оптоволокно, имплантированное в ткань исследуемой области мозга.
Оптогенетика способна решить проблему временной и пространственной специфичности процессов в неврологии. Использование оптогенети-кой сочетания генетических и оптических методов формирует баланс между плюсами и минусами подходов, ориентированных преимущественно на временную или пространственную компоненту, и тем самым обеспечивает анализ функции четко определенных событий в специфических клетках живой ткани [8]. Данная технология позволяет исследователям, изменяя активность нейронов светом, тем самым непосредственно контролировать поведение, а также любые функции организма, регулируемые этими нейронами. До сих пор этот метод применялся в исследованиях только на животных, но уже высказываются соображения о возможности его использования также и у людей.
ОПТОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ МЕХАНИЗМОВ ПСИХОЭМОЦИОНАЛЬНЫХ ПОВЕДЕНЧЕСКИХ ПРОЯВЛЕНИЙ
ДЕПРЕССИЯ. Структуры мозга, в которых при большой депрессии у людей, а также при депрессивно-подобных состояниях у животных наблюдаются изменения активности нейронов, включая районы, участвующие в регуляции эмоций и исполнительных функций, связанных с тревогой, увеличением устойчивости к негативной инфор-
мации, ангедонией, подавлением положительных эмоциональных реакций. В числе этих районов медиальная префронтальная кора, фронтальная часть поясной извилины, гиппокамп, латеральная уздечка, миндалина, вентральная область покрышки, прилежащее ядро, периакведуктальное серое вещество, а также системы моноаминерги-ческой (серотонинергической, норадренергиче-ской и дофаминергической) нейротрансмиссии [1, 26, 32].
Вовлечение префронтальной коры головного мозга в регуляцию проявлений дерессивно-по-добного поведения было продемонстрировано на модели нарушения социального взаимодействия, вызываемого у мышей хроническим стрессом поражения во внутривидовых агрессивных контактах [11]. В этих опытах лазерная стимуляция в период агонистического взаимодействия данной области мозга мышей с локально введенным вирусным вектором, экспрессирующим фоточувствительный, активирующий нейрон-ионный канал (СНЯ2-тСНеггу), полностью восстанавливала социальный ранг животных, что свидетельствует об антидепрессантном типе их поведения. Кроме того, фотостимуляция медиальной префронтальной коры "депрессивных" мышей предотвращала проявление у них еще одного симптома депрессии - ангедо-нии. У этих животных повышалось, по сравнению с контролем, потребление сахарозы [11].
С применением оптогенетической регуляции функции нейронов медиальной префронтальной коры и одновременной непрерывной электрофизиологической регистрации их активности у крыс в условиях свободного поведения выявлена связь модуляции разрядной активности этих нейронов с выбором животным той или иной стратегии поведения [31]. Разрядная активность многих нейронов этой структуры мозга оказалась не просто связанной с локомоторной активностью крысы, но специфически изменялась согласно переходу животного от пассивного (депрессивно-подобного) поведения к выбору активного способа реагирования на сложную тестовую ситуацию вынужденного плавания. Прямая неизбирательная активация нейронов префронтальной коры не оказывала при этом видимого влияния на это поведение. Однако, применяя оптогенетический подход для прицельной стимуляции клеток, имеющих специфические проекционные связи, обнаружено, что избирательная активация тех клеток префронтальной коры, которые посылают аксоны в серотонинергическое дорзальное ядро
шва (dorsal raphe nucleus), вовлеченное в формирование психоэмоционального состояния, индуцировала явный и быстрый выбор животным активной стратегии поведения [31].
Основными антидепрессантами в настоящее время являются препараты, влияющие на се-ротонин- и норадренергическую нейротранс-миссию [1], однако эксперименты, в которых применялись методы оптогенетики для анализа механизмов депрессии, сосредоточены в основном на анализе дофаминергических механизмов и, в частн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.