научная статья по теме ОРГАНОГЕНЕЗ GLORIOSA SUPERBA В КУЛЬТУРЕ IN VITRO Биология

Текст научной статьи на тему «ОРГАНОГЕНЕЗ GLORIOSA SUPERBA В КУЛЬТУРЕ IN VITRO»

ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 790-798

УДК 581.1

ОРГАНОГЕНЕЗ Gloriosa superba В КУЛЬТУРЕ In Vitro

© 2004 г. Г. Сивакумар, К. В. Кришнамурти*

Научный центр развития прогрессивных сельскохозяйственных технологий, Национальный университет, Шунгбук, Южная Корея * Отдел Науки о растениях, Университет им. Бхаратидасана, Тамил Наду, Индия

Поступила в редакцию 24.10.2003 г.

Разработан метод регенерации растений Gloriosa superba L. из эксплантов шести типов: корней, покоящихся и активных почек клубнелуковиц, молодых листьев, стеблей, цветоножек и апикальных почек воздушных побегов. Экспланты выделяли из растений, выращенных in vivo и in vitro. Для культивирования использовали среду MC с разными добавками ауксинов, цитокининов и других регуляторов роста в различных комбинациях. 98%-ное каллусообразование было достигнуто в тех случаях, когда в качестве эксплантов использовали активные почки клубнелуковиц. Для каллусов, полученных из клубнелуковиц, наблюдали образование наибольшего числа побегов (57). Во всех случаях при множественном побегообразовании наблюдали также усиленное корнеобразование. Морфологические и гистологические исследования показали, что растения, полученные в культуре in vitro, не отличались от растений in vivo ни по строению почек побегов и корней, ни по морфологии и структуре листьев.

Gloriosa superba - органогенез - колхицин - морфогенез in vitro

Растение Gloriosa superba L., относящееся к семейству Liliaceae, считается лекарственным благодаря высокому содержанию в нем алкалоидов, в основном колхицина и колхикозида. Затрудненное прорастание семян, поражаемость растений многими вредителями, а также интенсивный сбор G. superba в природе для медицинских целей позволяют отнести это растение к видам, находящимся под угрозой исчезновения [1]. Семена G. superba пользуются повышенным спросом на мировом рынке как основной источник колхицина и колхикозида [2]. Культивирование с помощью клубнелуковиц не может удовлетворить высокую коммерческую потребность в этом растении [3]. Поэтому клональное размножение с помощью культуры тканей может решить не только проблему сохранения данного вида, но и удовлетворения потребности в нем как в источнике колхицина.

Ранее уже предпринимались попытки кло-нального размножения G. superba. Первый шаг был сделан Somani с соавт. [4], однако им удалось получить лишь небольшое число побегов. Finnie

Сокращения: АС - аденилсульфат; ИМК - индолил-3-мас-ляная кислота; 2iP - изопентениладенин. Адрес для корреспонденции: G. Sivakumar. Research Center for the Development of Advanced Horticultural Technology, Chungbuk National University, Cheongju 361-763, South Korea. E-mail: sivakumar-libero.it

и van Staden [5] описали методику культивирование нескольких типов эксплантов, но сообщили о развитии побегов только из почек клубнелуковиц и о формировании каллусов во всех остальных случаях. Попытка Samarajeewa с соавт. [6] добиться органогенеза G. superba в культуре in vitro также закончилась неудачей.

Целью настоящей работы было изучение развития в культуре in vitro нескольких типов эксплантов G. superba (покоящихся и активных почек клубнелуковиц, апексов воздушных побегов, молодых листьев, стеблей, цветоножек и корней), получение из них здоровых побегов и стандартизация условий культивирования.

МЕТОДИКА

В качестве источника эксплантов для размножения использовали растения, выращенные из трехлетних клубнелуковиц в Ботаническом саду университета Bharathidasan (Tiruchirappalli, Индия), а также растения, выращенные из семян in vitro. Для получения растений in vitro хорошо развитые семена обрабатывали 1%-ным раствором Teepol 10 мин и отмывали проточной водой в течение 5 мин. Затем семена поверхностно стерилизовали погружением в 80%-ный этанол на 2 мин с последующей пятиминутной стерилизацией в ги-похлорите натрия. Семена несколько раз отмывали в стерильных условиях в дистиллированной воде и обрабатывали 1%-ным ГК3 в течение ночи. Затем семена снова отмывали 2 раза дистиллиро-

ванной водой и помещали на среду МС [7], содержащую 1% сахарозы, 1.44 мкмоль Гк3 и 4.44 мкмоль БАП. Семена инкубировали при 24 ± 2°С, 16-часовом фотопериоде и интенсивности освещения 70 мкмоль/(м2 с). Полученные проростки суб-культивировали каждые 2 нед., развившиеся растения поддерживали на среде МС с 2.72 мкмоль аденинсульфата (АС). Из этих растений выделяли экспланты для клонального размножения.

Шесть разных типов эксплантов выделяли из растений in vivo и in vitro: корни, молодые листья, стебли, цветоножки, почки клубнелуковиц (покоящиеся и активные) и апексы воздушных побегов. Экспланты помещали на поверхность среды МС, содержащей 2.5% сахарозы, а также 2,4-Д, кинетин, БАП и НУК. Регуляторы роста добавляли перед доведением рН среды до 5.8, перед ав-токлавированием при 121°С в течение 20 мин. Все культуры инкубировали при описанных ранее условиях.

Комбинации различных концентраций 2,4-Д и кинетина в среде позволили получить хорошо развитые, рыхлые, белые каллусы без органогенеза. Однако для некоторых культур наблюдали ризогенез. Каллусы после обработки различными комбинациями НУК и БАП были компактными и полурыхлыми. При культивировании на среде без ауксина с бАп, изопентиниладенином (2iP), АС и кинетином на каллусах начинался органогенез. Экспланты с индуцированными каллусами переносили на свежую питательную среду каждые 3 нед. в зависимости от скорости роста каллуса. Экспланты, не образующие каллуса или с медленно растущими каллусами, переносили на свежую среду каждые 4 нед. Скорость каллусооб-разования определяли как время, необходимое для того, чтобы первые 50% эксплантов образовали каллус. Интенсивность роста каллуса определяли по интервалу субкультивирования, необходимому для того, чтобы не менее 80% каллусов удвоили свои размеры. Культуры визуально оценивали и фотографировали с помощью микроскопа Meiji.

Каллусы со среды с 2,4-Д переносили на среду для регенерации, представлявшую собой среду МС с комбинациями БАП, 2iP, АС и кинетина в различных концентрациях. Культуры выращивали при условиях, описанных ранее. Для более сильной регенерации побегов (индукции побегообразования) каллусы, начавшие органогенез, субкультивировали с 3-недельным интервалом на среде, содержащей различные концентрации БАП, АС, кинетина и цитрата натрия. Побеги, образовавшиеся в результате множественного побегообразования, отделяли и помещали для дальнейшего роста в культуральные пробирки или конические колбы на среду МС с добавлением ГК3 на 35 сут.

Для индукции корнеобразования проксимальные концы побегов инокулировали на среде МС с индолил-3-масляной кислотой (ИМК) или НУК при ранее описанных условиях. Развитие корней наблюдали в течение 10-15 сут.

Для гистологических и морфологических исследований брали срезы каллусов на стадии органогенеза. Листья полученных in vivo и in vitro растений собирали, фиксировали Fast green и фотографировали с использованием бинокулярного микроскопа Nikon Labophot (Япония) с автоматической камерой Nikon FX-35A.

Подсчитывали частоту каллусообразования, а также общее число сформировавшихся корней и побегов. Все эксперименты проводили в трех по-вторностях (15 эксплантов в каждой повторности), в которых были получены похожие результаты. На графиках представлены средние величины.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Семена с интактной семенной кожурой не прорастали в культуре in vitro. Однако после надрезания кожуры более 40% семян прорастало на среде МС с 1.44 мкмоль ГК3 и 4.44 мкмоль БАП в течение 15 сут. Пятинедельные проростки имели одну семядолю и 3.5-сантиметровый главный корень (рис. 1а). Первоначально экспланты из покоящихся и активных почек клубнелуковиц, молодых листьев, побегов, цветоножек, корней и апексов культивировали для каллусообразования на среде МС с 2,4-Д и кинетином в концентрациях 0.452-4.64 мкмоль в течение 2-3 субкультивирований длительностью 7 сут (рис. 1б). Частота каллусообразования зависела от типа экспланта и от среды культивирования (рис. 2). Высокую частоту каллусообразования наблюдали в случае эксплантов из активных почек клубнелуковиц, молодых листьев, корней и апексов побегов, низкую -для эксплантов из спящих клубнелуковиц, стеблей и цветоножек (в последнем случае процесс каллусообразования занимал 3-4 субкультивирования). Около 98% эксплантов из активных почек клубнелуковиц, 96% - из молодых листьев, 95% -из апексов побегов, 87% - из корней, 78% - из покоящихся почек клубнелуковиц, 66% - из стеблей и 57% эксплантов из цветоножек образовывали каллусы после 5 нед. культивирования. Наиболее сильное образование каллусов для всех типов эксплантов наблюдали при концентрациях 4.52 мкмоль 2,4-Д и 2.32 мкмоль кинетина (рис. 2). Каллусы быстро разрастались и удваивали размер после каждого субкультивирования (21 сут) при переносе на свежую среду. Мягкие желтоватые каллусы разрастались в области надрезов у таких эксплантов, как активные клубнелуковицы, молодые листья, корни и апексы. Раздутые, с гранулированной структурой пролиферативные зоны формировались из спящих почек клубнелуковиц, стеблей и

Рис. 1. Развитие Gloriosa superba в культуре.

а - прорастание семян in vitro; б - пролиферирующий каллус; каллус, полученный из почки клубнелуковицы; в - регенерация растений; г - индукция множественного побегообразования; каллус, полученный из апекса побега; д - регенерация растений; е - индукция множественного побегообразования.

цветоножек. После двух-трех субкультивирований из них формировались мягкие желтоватые каллусы. Для этих эксплантов не наблюдали прямого органогенеза побегов. На среде МС без регуляторов роста каллусы вне зависимости от типа исходного экспланта становились белыми, а в дальнейшем подвергались некрозу. Однако в каллусах, культивируемых на среде МС с кинетином, формировались корни. При переносе на среду, содержащую 2,4-Д, каллусы сначала быстро разрастались, позднее у них менялась окраска и они становились коричневыми. Затем каллусы субкуль-тивировали на среде МС, содержащей различные концентрации БАП и НУК (2.29-10.74 мкмоль), где они хорошо разрастались.

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

Показать целиком

Пoхожие научные работыпо теме «Биология»