ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2009, том 56, № 6, с. 893-898
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОРГАНОСПЕЦИФИЧЕСКОЕ ИЗМЕНЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ СВОБОДНЫХ И КОНЪЮГИРОВАННЫХ ПОЛИАМИНОВ В РАСТЕНИЯХ МеБетЬгуаШкетиш сгуБЬаШпиш ПРИ ЗАСОЛЕНИИ
© 2009 г. Л. А. Стеценко, В. Ю. Ракитин, Н. И. Шевякова, Вл. В. Кузнецов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 01.11.2008 г.
Исследовали содержание свободных и конъюгированных полиаминов (ПА) в листьях вторичных побегов и корнях растений факультативного галофита Ме8етЬтуапШетит егуМаШнит Ь. при засолении. Растения выращивали в водной культуре и в возрасте 10 нед. подвергали солевому стрессу путем однократного введения в питательную среду №С1 до концентрации 400 мМ. Через 0, 6, 24 и 48 ч в листьях и корнях определяли содержание свободных, НС104-растворимых и НСЮ4-нераство-римых конъюгатов ПА. В корнях контрольных и подвергнутых солевому стрессу растений уровень свободных и конъюгированных ПА был выше, чем в листьях. В ответ на солевой шок в корнях и листьях увеличивалось содержание всех форм спермина (Спм), особенно его НС104-растворимых конъюгатов. Напротив, содержание предшественников Спм - путресцина (Пут) и спермидина (Спд), а также их НС104-растворимых конъюгатов снижалось. При засолении содержание свободного кадаверина как в корнях, так и в листьях возрастало, а его конъюгированных форм снижалось, что может свидетельствовать о превращении конъюгированных форм кадаверина в свободную. Продукт окислительной деградации Спм и Спд - 1,3-диаминопропан (Дап) - отсутствовал в листьях, тогда как содержание свободной и конъюгированных форм этого диамина в корнях в условиях засоления увеличивалось. Полученные данные свидетельствуют об органной специфичности содержания свободных и конъюгированных форм ПА, а также об активном их участии в процессе адаптации Mesembтyanthemum cтystallinum к солевому шоку.
Ключевые слова: Mesembryanthemum crystaШnum - засоление - свободные полиамины - ИСЮ4-рас-творимые конъюгаты полиаминов - ИСЮ4-нерастворимые конъюгаты полиаминов
ВВЕДЕНИЕ
Среди регуляторов физиологических процессов большой интерес представляют ПА (полиамины), которые являются биологически активными органическими катионами (спермин (Спм4+), спермидин (Спд3+), путресцин (Пут2+) и кадаверин (Кад2+)) и содержатся в растительных тканях в концентрациях от 10-9 до 10-5 М. ПА находятся в растениях в свободном состоянии или в виде связанных форм с низкомолекулярными соединениями и макромолекулами [1, 2]. При физиологических значениях рН ПА электростатически взаимодействуют с отрицательно заряженными фосфатными группами фосфолипидов, нуклеиновых кислот и с карбоксильными группа-
Сокращения: ПА - полиамины, Пут - путресцин, Кад - кадаверин, Спд - спермидин, Спм - спермин, Дап - 1,3-диами-нопропан.
Адрес для корреспонденции: Стеценко Лариса Алексеевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: 1arstet@mai1.ru
ми белков. ПА способны ковалентно связываться с белками на этапе посттрансляционной модификации [3, 4]. Образование конъюгатов ПА с белками, катализируют Са+2-зависимые и Са+2-неза-висимые трансглютаминазы (КФ 2.3.2.13). Эта группа ферментов катализирует реакцию между у-карбоксиамидной группой глутаминового остатка белка и соединениями, содержащими одну или несколько первичных аминогрупп [5]. Конъюгация ПА с полипептидами вызывает изменения активности ферментов и свойств белков [6]. Показано, что трансглютаминазы могут активироваться в стрессовых условиях [7].
ПА также образуют конъюгаты с оксикорич-ными кислотами с участием ацетил-СоА и амино-трансфераз [8]. Пут образует мономерную форму с кумаровой, кофейной или феруловой кислотами, а Спд и Спм - димеры или трехзамещенные конъюгаты с оксикоричными кислотами [9]. Такие конъюгированные формы ПА найдены во многих семействах растений и вызывают боль-
шой интерес вследствие их многочисленных функций [3, 7].
Наиболее важным свойством конъюгатов ПА с фенольными кислотами (HCЮ4-растворимые конъюгаты) при формировании стресс-адапта-ций у растений является их антиоксидантная активность. Впервые антиоксидантные свойства HCЮ4-растворимыx конъюгатов ПА растений изложены в работе [10], в которой показано, что свободные ПА по сравнению с их конъюгатами (с кофейной, кумаровой или феруловой кислотами) показали более низкие константы связывания со всеми типами активных форм кислорода. Отсюда следует, что у растений, испытывающих стрессовое воздействие, образование этих конъюгатов ПА должно способствовать снятию повреждающих эффектов. Однако образование конъюгатов ПА с фенольными соединениями в стрессовых условиях может в значительной степени зависеть от вида растений, содержания в них ПА и феноль-ных субстратов [8]. Конъюгаты ПА с низкомолекулярными соединениями представляют особый интерес, поскольку они обладают способностью к дальнему транспорту, возможно выполняя сигнальную роль [10, 11]. Эти конъюгаты важны для регуляции внутриклеточной концентрации свободных ПА [12]. Хотя в настоящее время не существует однозначного мнения относительно образования свободных ПА из их конъюгированных форм [4, 8], данные ряда авторов свидетельствуют о том, что конъюгаты ПА с оксикоричными кислотами участвуют в регуляции эндогенного пула свободных ПА [10-13].
Цель настоящей работы заключалась в изучении динамики содержания свободных, HCЮ4-рас-творимых и HCЮ4-нерастворимых конъюгатов ПА в листьях и корнях растений Мв8етЪгуаШНв-тит crystallinum при солевом стрессе.
МЕТОДИКА
Выращивание растений. Семена Ме8етЪгуап-Летит crystallinum L. проращивали во влажном перлите. Проростки в возрасте 2 нед. рассаживали по одному в сосуды с 1 л питательной среды Джонсона [14] и выращивали в условиях водной культуры в камере фитотрона при 12-часовом фотопериоде (натриевые лампы Reflax-250, Россия), интенсивности света 150 мкмоль/(м2 с), температуре воздуха 23 ± 1/16 ± 1°С (день/ночь) и относительной влажности воздуха 55/70% (день/ночь). Питательную среду в сосудах непрерывно барботировали воздухом - 50 мл/мин.
Растения в возрасте 10 нед. подвергали засолению. Для этой цели в питательную среду одноразово вносили до концентрации 400 мМ. В ка-
честве контроля использовали растения, выращенные на питательной среде без засоления. Пробы листьев и корней растений отбирали через 0, 6, 24 и 48 ч после внесения NaCl, фиксировали жидким азотом и хранили при -70°С.
Определение содержания свободных и конъюгированных полиаминов. Навеску (0.5 г) замороженной ткани растений помещали в охлажденную фарфоровую ступку, приливали 5 мл 5% HClO4, в качестве внутреннего стандарта вносили 25 мкл 1 мМ 1,6-диаминогексана ("Sigma", США) и гомогенизировали. Гомогенат выдерживали 1 ч при 0°С, затем фильтровали под вакуумом на микроволоконном стеклянном фильтре GF/C ("Whatman", Великобритания). Половину объема фильтрата использовали для определения свободных ПА, а вторую - для определения HCЮ4-раство-римых конъюгатов ПА. В осадке, полученном при фильтровании гомогената, определяли HCIO^to-растворимые конъюгаты ПА. Для определения ПА, содержавшихся в конъюгатах, осадок и фильтрат подвергали кислотному гидролизу в 6 N HCl в течение 24 ч при температуре 95 ± 1°С в запаянных стеклянных ампулах [15].
Полисахариды, содержащиеся в листьях M. crystallinum [16, 17], мешали определению HCЮ4-растворимыx конъюгатов ПА. Так, после кислотного гидролиза не удавалось обнаружить не только свободные ПА и ПА, входившие в состав конъюгатов, но также и добавленный к образцу внутренний стандарт - 1,6-диаминогексан. Для удаления полисахаридов из листовых экстрактов был использован метод, применяемый для осаждения полисахаридов при выделении нуклеиновых кислот из растений [18].
С этой целью в фильтрате экстракта из листьев перед гидролизом доводили рН до 4.5, добавляли 2-бутоксиэтанол ("Sigma") до его концентрации в среде, равной 28.5 объемных % [15], и выдерживали 30 мин при 0°С для формирования осадка. Гелеподобный осадок удаляли фильтрованием под вакуумом на фильтре GF/C. Фильтрат высушивали в фарфоровых чашках на водяной бане при 70°С, растворяли в 5 мл 6 N HCl и подвергали гидролизу по описанному выше методу.
Гидролизаты корней и листьев высушивали в фарфоровых чашках на водяной бане при температуре 70°С, затем растворяли в 5 мл 5% HClO4. ПА определяли в виде бензоильных производных методом ВЭЖХ [19] с модификациями [20] на жидкостном хроматографе высокого давления HP 1090 ("Hewlett-Packard", США). Гидролизаты экстрактов содержали сумму свободных ПА и ПА, освободившихся из HCЮ4-растворимыx конъюгатов. Количество ПА, входивших в состав
Экспозиция, ч
Рис. 1. Динамика изменения содержания свободных и конъюгированных полиаминов в корнях M. crystallinum при действии солевого стресса (400 мМ NaCl, 6-48 ч).
а - спермидин; б - спермин; в - кадаверин; г - путресцин; д - диаминопропан. 1 - свободные ПА; 2 - HCЮ4-раствори-мые конъюгаты ПА; 3 - HCЮ4-нерастворимые конъюгаты ПА.
HCЮ4-растворимыx конъюгатов, рассчитывали по разнице значений суммарного содержания ПА в гидролизате экстрактов и свободных ПА, которые определяли в экстрактах, не подвергавшихся гидролизу. Гидролизаты HCЮ4-нерастворимыx конъюгатов ПА содержали только ПА, освобо-
дившихся в результате гидролиза осадков, образовавшихся при фильтровании гомогената на микроволоконном стеклянном фильтре GF/C.
Данные получены в трех биологических по-вторностях. Обработку данных проводили методами математической статистики [21].
160 г
(а)
0 6 24 Экспозиция, ч
48
0 6 24 48 Экспозиция, ч
Рис. 2. Динамика изменения содержания свободных и конъюгированных полиаминов в листьях вторичных побегов М. crystallinum при действии солевого стресса (400 мМ №С1, 6-48 ч).
а - спермидин; б - спермин; в - кадаверин; г - путресцин. 1 - свободные ПА; 2 - НС104-растворимые конъюгаты ПА; 3 - НСЮ4-нерастворимые конъюгаты ПА.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Динамика содержания свободных и конъюгированных ПА в корнях и листьях вторичных побегов М. cтystallinum при солевом стр
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.