ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 3, с. 397-408
УДК 581.1
ОРГАНОСПЕЦИФИЧНОСТЬ И ИНДУЦИБЕЛЬНОСТЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПРОМОТОРА ГЕНА ПАТАТИНА КЛАССА I КАРТОФЕЛЯ В ТРАНСГЕННОМ АРАБИДОПСИСЕ
© 2007 г. Е. М. Наумкина, Ю. П. Болякина, Г. А. Романов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 02.10.2006 г.
Пататиновый промотор класса I (В33-промотор) является тканеспецифичным промотором картофеля (Solanum tuberosum L.), экспрессирующим ген пататина преимущественно в клубнях, но может быть индуцирован и в других органах сахарозой или светом. Мы исследовали активность В33-про-мотора, соединенного с репортерным геном, при гетерологичной экспрессии в B33::G^S трансгенных растениях арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) и сравнивали с гомологичной экспрессией той же конструкции ДНК в картофеле. Уровень активности В33-промотора количественно определяли на основе активности Р-глюкуронидазы (GUS). При гетерологичной экспрессии в проростках арабидопсиса тканеспецифичность и индуцибельность В33-промотора сохранялись, хотя были выражены иначе по сравнению с гомологичной экспрессией в картофеле. Основным органом функционирования В33-промотора в неидуцированном арабидопсисе являлся корень, а при воздействии экзогенно добавленной сахарозы им становились семядоли. 10 мМ сахарозы было достаточно для повышения во много раз активности В33-промотора в целых проростках. Степень индуцибельности пататино-вого промотора в проростках арабидопсиса была строго органоспецифична и резко возрастала в ряду корень < гипокотиль < семядоли. Активность В33-промотора в семядолях при воздействии 150-250 мМ сахарозы увеличивалась в 200-300 раз, что во много раз превышало степень индукции данного промотора в органах растений картофеля. Глюкоза и фруктоза действовали гораздо слабее, чем сахароза. Фитогормоны, влияющие на клубнеобразование у картофеля (гиббереллины, ауксины, цитокинины), не оказали заметного влияния на функционирование В33-промотора в арабидопсисе. Активации сахарами В33-промотора предшествовал лаг-период длительностью примерно 6 ч, что служит указанием на то, что пататиновый промотор не является первичной мишенью для сахарозного сигнала. Выявленные новые количественные закономерности гетерологичной экспрессии пататинового промотора класса I картофеля способствуют лучшему пониманию его базовых функциональных характеристик и позволяют точнее прогнозировать его поведение при переносе в другие виды растений.
Arabidopsis thaliana - Solanum tuberosum - пататиновый промотор В33 - гетерологичная экспрессия гена - индукция сахарами - индукция светом - сахароза - GUS
ВВЕДЕНИЕ
Дифференциальная экспрессия генов составляет молекулярную основу онтогенеза и органогенеза всех многоклеточных организмов, включая растения. Регуляция экспрессии генов происходит в значительной мере на уровне транскрипции, где ведущая роль принадлежит их регуляторной зоне -промотору. В связи с этим исследование функциональных и структурных особенностей промоторов генов является одной из важнейших задач совре-
Сокращения: GUS - ß-глюкуронидаза; MU - 4-метилумбел-лиферон; MUG - 4-метилумбеллиферил^-глюкуронид. Адрес для корреспонденции: Романов Георгий Александрович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: gar@ippras.ru
менной биологии. Кроме того, знание особенностей функционирования промоторов важно и для практических целей, например при создании трансгенных растений [1-3].
Главный запасной белок клубня картофеля -пататин - кодируется мультигенным семейством [4, 5]. Гены этого семейства активно функционируют главным образом при формировании и росте клубня [6], поэтому их удобно использовать в качестве модельной системы для изучения орга-носпецифичной регуляции генной экспрессии. Гены, кодирующие пататин, делятся на два класса согласно структурным характеристикам и профилям экспрессии [4, 5, 7]. Гены класса I, характеризующиеся отсутствием 22-нуклеотид-ной последовательности в 5'-нетранслируемой области, активно экспрессируются в развивающихся клубнях, а в листьях их экспрессия может
быть индуцирована экзогенной сахарозой [8, 9]. С использованием трансгенных растений картофеля с репортерным геном ß-глюкуронидазы (GUS) под контролем промотора пататина класса I установлено, что участок промотора размером ~1.5 т.п.н. необходим и достаточен для клубнеспе-цифичной и сахарозо-индуцибельной экспрессии соединенного с ним гена [9, 10]. В последующих работах были предположительно идентифицированы цис-элементы и транс-факторы, вовлеченные в регуляцию активности промотора гена пататина класса I [9-13]. В отличие от генов патати-на класса I, гены пататина класса II заметно экспрессируются не только в клубнях, но и в корнях; при этом их экспрессия нечувствительна к сахарозе [4, 14].
Одним из современных подходов исследования функциональных особенностей промоторов является анализ их активности в условиях гетероло-гичной экспрессии, т.е. в трансгенных растениях. Обычно для этих целей промотор объединяют с кодирующей последовательностью какого-либо репортерного белка, заметно не влияющего на метаболизм клетки и развитие растения [15]. При гетерологичной экспрессии, особенно у филогенетически отдаленных видов, проявляются как высококонсервативные универсальные системы регуляции генной активности, так и механизмы регуляции, свойственные отдельной группе растений или данному виду. Например, исследование промоторов SAG-генов, активирующихся у ара-бидопсиса при переходе к старению, выявило сходную динамику активности при их гетерологичной экспрессии в листьях томатов [16]. С другой стороны, промотор VR-ACS1 из Vigna radiata, который слабо функционирует в естественных условиях и способен к индукции под влиянием разных факторов, при пересадке в растения табака и арабидопсиса проявлял мощную конститутивную экспрессию [17]. Пататиновый промотор картофеля также был использован для изучения гетерологичной экспрессии в растениях арабидопсиса [18, 19]. Было показано, что гетерологич-ная экспрессия промотора класса I тканеспеци-фична и может активироваться под влиянием сахарозы, а также пролина [18, 19].
Однако исследование действия промотора пататина у арабидопсиса было проведено в основном на качественном уровне, с применением гистохимического окрашивания. Данный метод имеет свои ограничения, поэтому в настоящей работе мы провели детальный количественный анализ функционирования промотора пататина класса I (В33-промотора) картофеля в трансгенном B33::GUS арабидопсисе с применением флю-ориметрического определения активности репортерного фермента. Особенности гетерологичной экспрессии промотора сопоставлены с характеристиками его гомологичной экспрессии в расте-
ниях кapтофeля. Выявленные новые количественные и вpeмeннЫ е пapaмeтpы гeтepологич-ной экcпpeccии пататинового пpомотоpa способствуют более глубокому пониманию моле-кyляpныx механизмов peгyляции его активности in planta.
МЕТОДИКА
В paботe использованы пpоpоcтки тpaнcгeн-ного Arabidopsis thaliana (экотип С24), экcпpeccи-pyющиe peпоpтepный ген GUS под кошролем тканеспецифичного пpомотоpa гена пататина класса I кapтофeля paзмepом ~1.5 т.п.н. (В33). Эти тpaнcфоpмaнты получены путем а^обакте-pиaльной тpaнcфоpмaции штаммом Agrobacteri-um tumefaciens PGV 2260 [18]. Семена тpaнcгeнно-го B33::GUS apaбидопcиca были любезно пpeдо-ставлены пpоф. Hanjo Hellmann (Бepлин, Гepмaния). В качестве отpицaтeльного кошроля использовали пpоpоcтки нeтpaнcгeнного apa6^ допсиса.
Tpaнcгeнный B33::GUS кapтофeль (Solanum tuberosum L.) линии L1 был получен в лaбоpaто-pии pоcтa и paзвития ИФР РАН в peзyльтaтe аг-pобaктepиaльной тpaнcфоpмaции с вeктоpом pBin19-B33::GUS [8], котоpый был любезно пpeдоcтaвлeн пpоф. L. Willmitzer (Потсдам-Гольм, Гepмaния). Подтвepждeниe тpaнcгeнноcти полученных pacтeний пpовeдeно pядом независимых методов (устойчивость к канамицину, активность GUS, полимepaзнaя цепная pea^ra (ПЦР) на элементы конструкции ДНК, пpовepкa на отсутствие aгpобaктepий), включая использование cпeциaлизиpовaнныx микpочипов [20]. Растения кapтофeля paзмножaли in vitro в условиях фито-тpонa на свету (16-часовой день), как описано pa-нее [21]. Опыты пpоводили на paCT^^x в воз-pacre пpимepно 2.5 мес., выфащенныи на 3%- или 8%-ной caxapозe в cpeдe на свету или в темноте.
Общая методология постановки опытов с пpо-pоcткaми apaбидопcиca описана pa^e [22]. Все опыты пpоводили на тpexднeвныx пpоpоcткax. Семена apaбидопcиca выдepживaли в дистилли-pовaнной воде на холоду (3-5°С) в течение тpex суток, после чего пpоpaщивaли в воде тpоe суток на 14-часовом световом дне пpи 23-24°C. Для опpeдeлeния влияния света и темноты на активность пpомотоpa часть семян пpоpaщивaли па-paллeльно в условиях полной темноты в течение тpex суток. Mepой интенсивности paботы B33-пpомотоpa служила активность мapкepного фepмeнтa GUS.
В опытах по изучению влияния экзогенных са-xapов тpexднeвныe пpоpоcтки apaбидопcиca pac-кладывали по 10 штук в лунки пластикового кла-cтepa ("Costar", США) с диcтиллиpовaнной водой, куда вносили caxapa до тpeбyeмой концeнтpaции
(0-300 мМ). Общий объем инкубационной смеси составлял 400 мкл. Каждый вариант выполняли не менее чем в двух повторностях. Проростки инкубировали в темноте при 23-24°С в течение определенного времени (от 0 до 18 ч). Затем определяли активность фермента GUS по стандартной схеме (см. ниже).
Для анализа действия фитогормонов трехдневные проростки раскладывали по лункам, куда добавляли гормоны (БАП, ГА4 + 7, ПУК или 2,4-Д) до заданных концентраций. Далее проростки инкубировали 7 ч при 23-24°C, отмывали дистиллированной водой и определяли активность фермента GUS. В качестве положительных контролей на действие цитокинина и ауксинов использовали трансформанты арабидопсиса с ци-токинин- и ауксин-чувствительными промоторами, ARR5::GUS и DR5::GUS, соответственно. Отрицательными контролями служили проростки нетрансгенного арабидопсиса.
Определение активности GUS проводили гистохимическим и флюориметрическим методами по
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.