БИОХИМИЯ, 2014, том 79, вып. 7, с. 821 — 833
УДК 577.152.3
ОРТОЛОГ ФАКТОРА ОТСУТСТВИЯ ГЛАЗ Caenorhabditis elegans EYA-1 НЕОБХОДИМ ДЛЯ ОБЕСПЕЧЕНИЯ УСТОЙЧИВОСТИ К СТРЕССАМ*
© 2014 Бин-йин Ванг1,2, Ксю-сонг Ксю3, Ю-хао Чуи1,2, Хуа Ванг12, Хе Лю12, Жи-жон Жо Жао4, Йун-фенг Ма12**, Ксю-кюи Фу12**
1 Государственная инженерная лаборатория ВИЧ-вакцин, Университет Цзилиня, Чжангчун, КНР; факс: (86)431-85155152, E-mail: mjf@jlu.edu.cn
2 Ключевая лаборатория молекулярной энзимологии и инженерии, Министерство образования, Университет Цзилиня Чжангчун, КНР
3 Китайско-японская объединенная больница, Чжангчун, КНР
4 Центр наук о здоровье Университета Оклахомы, Оклахома 73104, США
Поступила в редакцию 08.03.14 После доработки 02.04.14
Фактор отсутствия глаз (eya) является высококонсервативным транскрипционным кофактором и одновременно фосфатазой белков и регулирует множество процессов, происходящих в ходе развития многоклеточных животных. Данный белок обладает двойной функцией, работая в ядре в качестве транскрипционного фактора и функционируя в качестве тирозиновой киназы в цитоплазме. В данной работе мы выделили единственный гомолог фактора отсутствия глаз у Caenorhabditis elegans — EYA-1 и разработали эффективную систему подавления экспрессии соответствующего гена с помощью РНК-интерференции, основанную на питании животного. Нам удалось установить, что нокдаун EYA-1 снижает устойчивость к тепловому и окислительному стрессам, ускоряя развитие паралича, вызываемого протеотоксичностью Ap1—42 и поли-Q. При тепловом стрессе (35°) нокдаун EYA-1 снижает среднюю продолжительность жизни на 16,8%, что может быть связано со снижением экспрессии гена белка теплового шока 16,2 (hsp-16.2). В условиях окислительного стресса нокдаун укорачивает среднюю продолжительность жизни на 18,7%, что, видимо, опосредовано накоплением внутриклеточных АФК и снижением экспрессии гена супероксиддисмутазы-3 (sod-3). Помимо этого, у животных с нокдауном EYA-1 при окислительном стрессе наблюдалось повышенное накопление липофусцина. Дальнейшие исследования показали, что нокдаун EYA-1 не ингибировал накопление в ядре daf-16 в ответ на стресс у червей дикого типа. С другой стороны, недостаток EYA-1 не приводил к дальнейшему снижению стрессоустойчивости у мутантных по гену daf-16 животных, чувствительных к стрессам. С помощью количественной ПЦР в реальном времени показано, что экспрессия двух генов-мишеней daf-16 — hsp-12.3 и sod-3 снижалась в стрессовых условиях при РНКи-опосредованном подавлении EYA-1. Все установленные факты указывают на то, что EYA-1 необходим для устойчивости червей к стрессовым условиям и, по всей видимости, действует как регулятор экспрессии ассоциированных со стрессоус-тойчивостью генов уровнем ниже, чем daf-16.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: EYA-1, Caenorhabditis elegans, РНК-интерференция, устойчивость к стрессу.
Ген фактора отсутствия глаз (еуа) кодирует высококонсервативный транскрипционный ко-активатор и фосфатазу белков. Впервые он был обнаружен у Drosophila как ген, необходимый
для формирования глаз [1—3], его гомологи необходимы для развития различных организмов в ряду от насекомых до человека [4, 5]. У высших животных гены, регулируемые eya, вовлечены в
NGM - пи-
in Press, BM
Принятые сокращения: GFP — зеленый флуоресцирующий белок, HSP-16.2 — белок теплового шока, тательная среда для нематод, РНКи — РНК интерференция, АФК — активные формы кислорода.
* Первоначально английский вариант рукописи был опубликован на сайте «Biochemistry» (Moscow), Papers 14-063, 01.06.2014. ** Адресат для корреспонденции.
развитие множества органов, таких как глаза, мышцы, уши, сердце, легкие, эндокринные железы, плакода, глоточный карман, черепно-ли-цевой скелет и паращитовидная железа [6]. У Drosophila специфичные рецессивные мутации по еуа приводят к исчезновению фасеточных глаз у жизнеспособных мух, в то время как нулевые мутации этого гена летальны для эмбрионов [1]. Мутации по еуа у мышей проявляются в нарушениях апоптоза и снижении клеточной пролиферации при формировании множества тканей, таких как почки, мышцы и уши [7]. У человека еуа также связан с развитием некоторых заболеваний, в частности, полиорганного нарушения развития с бранхио-ото-ренальным синдромом [8], врожденной катаракты [9], глухоты с отложенным началом [7]. Помимо этого, еуа гиперэкспрессирован в некоторых видах раковых опухолей [10, 11].
Геном нематоды Сает^аЪйШз elegans содержит гомолог определяющего развитие глаз гена, Е1Л-1. Фуруя с соавт. [12] показали, что утрата функции БУА-1 с помощью РНК-интерференции (РНКи) и делеционного мутагенеза с неполной пенетрантностью приводит к ранней смертности личинок, которая ассоциирована с нарушениями в дифференциации и морфогенезе некоторых тканей и органов. Хирозе с соавт. [13] обнаружили, что у С. elegans гомеодоменный белок 8к-семейства СЕН-34 и ортолог фактора отсутствия глаз (ЕУА-1) вызывают программируемую клеточную смерть определенных фа-рингеальных нейронов. В данной работе мы выделили единственный у С. е^ат гомолог фактора отсутствия глаз (еуа) — ЕУА-1 и разработали эффективную систему подавления экспрессии его гена путем РНКи, основанную на питании животного. Нам удалось установить, что нокдаун ЕУА-1 может вызвать значительное сокращение продолжительности жизни С. е1е-gans в стрессовых условиях, при этом при нормальных условиях культивирования продолжительность жизни червей не меняется. Исходя из этого, мы предположили, что ЕУА-1 может быть необходим для обеспечения устойчивости С. е1е-gans к стрессам. Полученные нами результаты также указывают на то, что у С. elegans ЕУА-1 участвует в йа/-16-опосредованном механизме устойчивости к стрессам. Помимо этого, мы показали, что нокдаун ЕУА-1 снижает устойчивость к стрессам путем подавления экспрессии ассоциированных со стрессоустойчивостью генов — зой-3, hsp12.3 и hsp-16.2. Мы полагаем, что полученные нами результаты будут способствовать более широкому рассмотрению молекулярных механизмов функционирования ЕУА-белков.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Штаммы C. elegans. Все штаммы C. elegans культивировались при 20°, за исключением тем-пературочувствительного штамма CL4176. Использовались следующие штаммы: N2 Bristol (дикий тип), CL2070 (hsp16.2::gfp), CF1553 muIs84 \pAD76(sod-3::gfp), BA17, fem-1(hc17) (фертиль-ный при 20°, стерильный при 25°), CL4176 (dvIs27\pAF29(myo-3/Ap 1—42/let UTR) + pRF4(rol-6(su1006)]), AM140 (rmIs132\P(unc-54) Q35::YFP]), TJ356 zIs356 \daf-16::gfp + rol-6] и CF1038 daf-16(mu86).
Молекулярное клонирование EYA-1. Ориентируясь на полноразмерную нуклеотидную последовательность гена EYA-1 C. elegans из базы данных www.wormbase.org, мы амплифицирова-ли кодирующую часть гена с использованием праймеров EYAf: 5'-AAAATGCTTCCAGATTCT-GAGGGTCAAAA-3' и EYAr: 5'-ATTATCCGCC-CAACAAAAAGTTGTCCA-3'. ПЦР-продукты длиной 1501 п.н. были клонированы в векторе pBluescript II KS. Последующее секвенирование клонированных фрагментов подтвердило их идентичность нуклеотидным последовательностям базы данных.
Нокдаун EYA-1. Полноразмерная кодирующая последовательность EYA-1 была клонирована в составе вектора pPD129.36. В качестве контроля использовался пустой вектор p129.36. Для синтеза двуцепочечных РНК (дцРНК) использовали штамм Escherichia coli HT115 (DE3), индукцию синтеза дцРНК проводили добавлением 0,4 мМ IPTG. Эффективность РНКи-опосредованного нокдауна подтверждали вес-терн-блот-гибридизацией с антителами к EYA-1 (получены в лаборатории доктора Жао).
Получение белковых экстрактов C. elegans и вестерн-блот-анализ. Экстракты были получены из червей смешанной популяции путем дезинтеграции ультразвуком в буфере для полной экстракции (25 мМ 2-глицеролфосфатаза (pH 7,3), 5 мМ ЭДТА, 5 мМ ЭГТА, 0,1 М NaCl, 1%-ный Тритон X-100, 10 мМ p-меркаптоэтанол) с добавлением коктейля ингибиторов протеиназ («Roche Applied Science», Германия). Образцы, содержавшие 20 мкг общего белка, разделяли в 10%-ном Ds-Na-ПААГ и переносили на мембрану из поливинилидендифторида (PVDF) для последующего вестерн-бл от-анализа с использованием метода усиленной хемилюминесцен-ции.
Иммуногистохимия. Червей собирали коротким центрифугированием, после чего фиксировали в 4%-ном параформальдегиде в течение ночи. Затем дегидратировали абсолютным этанолом, заливали в парафин и готовили срезы
толщиной 3 мкм. Перед проведением анализа срезы прогревали в присутствии 0,01 M натрий-цитратного буфера (pH 6) на водяной бане при 95° в течение 15 мин, а затем последовательно обрабатывали первичными и вторичными антителами (конъюгированными с биотином антителами лошади к IgG мыши, «Vector Laboratories», США).
Тестирование продолжительности жизни и устойчивости к стрессам. Животных репродуктивного возраста помещали на чашки со свежей средой для роста нематод (NGM) и оставляли на 2 ч для кладки яиц с целью получения синхронизированных по возрасту групп червей. Синхронизированных по возрасту молодых личинок (L1) культивировали на чашках с NGM, содержавших клетки E. coli, несущие контрольный вектор или РНКи EYA-1, при 20 или 25°. По достижении червями взрослого возраста (L4) их ежедневно пересаживали в течение шести дней для избегания смешивания поколений. После этих шести дней пересаживание осуществляли через день. Черви считались мертвыми при отсутствии реакции на стимул прикосновения.
Исследования теплового шока проводили при 30 и 35° на червях возрастом четыре дня. И контрольных животных, и подверженных РНКи червей культивировали при 20° в течение четырех дней, а затем переносили в инкубатор при температуре 30 или 35°. Число мертвых червей подсчитывали каждые 2 ч при 30° или каждые полчаса при 35°.
Высокие концентрации юглона (5-гидрок-си-1,4-нафтахинона), являющегося генератором АФК, обладают поражающим действием на клетки и организмы в целом. Синхронизированных по возрасту молодых личинок (L1) культивировали на чашках с NGM, содержавших клетки E. coli, несущие контрольный вектор или EYA-1 РНКи, при 20° в течение четырех дней. После этого контрольных и подвергавшихся РНКи червей переносили в 96-луночные планшеты, содержавшие 200
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.