ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2004, том 40, № 5, с. 505-512
УДК 577.152.1+579.22
ОСАЖДЕННЫЕ, СООСАЖДЕННЫЕ И УГЛЕМИНЕРАЛЬНЫЕ АДСОРБЕНТЫ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ КАТАЛАЗЫ
Pénicillium piceum F-648
© 2004 г. А. H. Еремин*, M. В. Макаренко*, А. П. Дрожденшк*, И. В. Мороз**, Р. В. Михайлова**
*Институт биоорганической химии НАН Белоруссии, Минск, 220141; e-mail: eryomin@iboch.bas-net.by **Институт микробиологии НАН Белоруссии, Минск, 220141; e-mail: enzyme@mbio.bas-net.by Поступила в редакцию 31.07.2003 г.
Проведено сравнение эффективности связывания каталазы (КАТ, КФ 1.11.1.6) из фильтрата куль-туральной жидкости (ФКЖ) гриба Pénicillium piceum F-648 с использованием различных адсорбентов. Фосфат кальция, гидроксиапатит (ГАП), соосажденные адсорбенты, содержавшие гидроксиды магния и алюминия, и углеминеральные адсорбенты, включавшие фосфат кальция или гидроксид магния, более эффективно связывали внеклеточную КАТ, чем оксид и фосфат алюминия, кварцевый песок. Фермент выделен из ФКЖ гриба P. piceum с использованием ГАП и двухкомпонентного соосажденного адсорбента (Ca3(PO4)2 + Mg(OH)2, 1 : 1) (СМ). Образец КАТ(СМ) содержал минимальное количество примесных белков, характеризовался максимумами в спектре поглощения при 279.6; 406.8 (полоса Соре), 540, 585, 636 и 703 нм и минимумами отрицательной молярной эллиптичности при 207 и 210-214 нм. Кинетические характеристики образцов (Км, Умакс/Км, удельная активность) сложным образом зависели от концентрации белка в среде реакции. В разбавленных растворах Км и удельная активность КАТ(СМ) и КАТ(ГАП) равны 667 и 137 мМ, 300.9 х 104 и 30.0 х 104 МЕ/мг белка соответственно. Эффективные константы скорости инактивации КАТ(ГАП), КАТ(СМ) и ФКЖ в ходе разложения H2O2 резко возрастали при разведении образцов и в бесконечно разбавленном растворе составляли 4.30 х 10-2, 6.46 х 10-2 и 1.12 х 10-2 с-1 соответственно.
Каталазы (КФ 1.11.1.6) принадлежат к числу наиболее изучаемых ферментов, так как они катализируют метаболически значимую реакцию разложения H2O2 и применяются в ряде биотехнологических процессов [1-3]. Поэтому поиск перспективных источников получения фермента и разработка простых способов его выделения и иммобилизации является актуальной практической задачей.
Обычно каталазы содержат четыре субъединицы и имеют молекулярную массу в пределах 220-270 кДа [1]. Активными продуцентами каталаз являются микроскопические грибы родов Aspergillus и Pénicillium [1, 4, 5]. Грибы рода Pénicillium способны синтезировать внеклеточные каталазы [4, 5], которые содержат углеводный компонент и являются гликопротеинами [6, 7]. При очистке ка-талаза разделяется на несколько фракций, обладающих равной каталитической активностью [7].
Сокращения: ГАП - гидроксиапатит, КАТ(ГАП) - образец каталазы, полученный с использованием гидроксиапа-тита, КАТ(СМ) - образец каталазы, выделенной из ФКЖ с использованием соосажденных Ca3(PO4)2 + Mg(OH)2 (1 : 1), СМ - соосажденный адсорбент (Ca3(PO4)2 + Mg(OH)2, 1 : 1), ФКЖ - фильтрат культуральной жидкости гриба Pénicillium piceum F-648.
Изоэлектрическая точка каталазы равна 5.4 [8]. Высокоочищенные каталазы из разных источников характеризуются удельной активностью в диапазоне (2.07-27.4) х 104 МЕ/мг белка [2, 9]. Удельная активность и константа Михаэлиса каталаз P. vitale, A. niger и печени быка равны 3.0 х 104, 2.14 х 104, 9.18 х 104 МЕ/мг белка и 231, 465, 93 мМ соответственно [2, 9].
В качестве источника внеклеточной каталазы выбран гриб Penicillium piceum F-648, продуцирующий фермент в условиях глубинного и поверхностного культивирования [4]. Каталаза P. piceum характеризуется не только высокой каталитической активностью, но и повышенной операционной стабильностью [10-12].
При выделении внеклеточных каталаз приходится работать с культуральной жидкостью, содержащей незначительную концентрацию целевого белка. В этом случае для концентрирования и очистки ферментов используют ультрафильтрацию [10, 13]. Эта методика проста в исполнении, но продолжительна, так как в процессе ультрафильтрации на мембране формируется гель-слой, тормозящий процесс выделения целевого белка. Ускорить выделение белков можно путем хрома-
тографии в объеме на неорганических адсорбентах. Процесс выделения каталазы удалось ускорить при хроматографировании фильтрата культуральной жидкости (ФКЖ) Р. рквыт на СаБ-геле [14]. С использованием СаБ-геля методом хроматографии в объеме из ФКЖ Р. рквыт выделены две формы каталазы, характеризовавшихся удельной активностью, равной (58.8-80.6) х 104 МЕ/мг белка, константой Михаэлиса - 505-541 мМ и эффективной константой скорости инактивации каталазы в ходе разложения пероксида водорода при 30°С -(1.55-1.60) х 10-2 с-1. В настоящее время разработаны методики получения многочисленных соосаж-денных и углеминеральных адсорбентов [15], которые можно использовать для фракционирования белков.
Цель работы - сравнение эффективности связывания внеклеточной каталазы Р. рквыт Б-648 с осажденными, соосажденными и углеминераль-ными адсорбентами, содержавшими гидроксиды и фосфаты кальция, алюминия, магния и цинка, и характеристика свойств фермента.
МЕТОДИКА
В работе использовали ФКЖ (26.1 мкг/мл белка) Р. р1свыт Б-648, полученный в результате глубинного культивирования продуцента [14], нейтральную окись алюминия (Ь 40/250; "СИешаро1", Чехия), активированный уголь (стерильный, апиро-генный, марка А), хлориды и гидроксиды алюминия, кальция, цинка и магния, фосфорную кислоту производства "Реахим" (Россия). Гидроксиапатит (ГАП) получали методом, описанным в работе [16].
Применяли просеянную фракцию аллювиального речного песка, размолотого в фарфоровой ступке (0.16 меш). В процессе подготовки песка как адсорбента его многократно промывали дистиллированной водой с целью удаления примесей растительного происхождения, обрабатывали концентрированной соляной кислотой для удаления карбонатов и оксидов железа. От кислоты песок отмывали дистиллированной водой, высушивали при 120-130°С и прокаливали в муфеле при 650°С.
Синтез адсорбентов. В термостатированный сосуд, снабженный механической мешалкой, вносили расчетные количества водных растворов ор-тофосфорной кислоты, соответствующих хлоридов металлов (осажденные и соосажденные адсорбенты), а в случае углеминеральных адсорбентов в раствор солей и кислоты добавляли активированный уголь. Температуру раствора доводили до 50°С. Затем в раствор с помощью перистальтического насоса медленно добавляли 1 М или 2 М КаОИ. Величину рН среды синтеза адсорбента контролировали с помощью рН-метра. Полученную суспензию адсорбента перемешивали в течение 3-5 ч. Адсорбенты многократно промывали дистилли-
рованной водой, воду удаляли и осадки сушили при 100-120°С.
Выделение каталазы P. piceum. В центрифужные стаканы помещали по 1 г сорбента (ГАП или СМ). Сорбент два раза промывали дистиллированной водой для удаления мелкодисперсных частиц. В каждый центрифужный стакан к промытому сорбенту добавляли по 60 мл предварительно разведенного в 3 раза ФКЖ (9 мкг белка/мл). Полученную суспензию перемешивали 3 ч при комнатной температуре, центрифугировали (5 мин, 4000 g), супернатант удаляли, а сорбент 3 раза промывали дистиллированной водой. Каталазу элюировали 50 мМ фосфатным буфером, рН 7.0. Сорбент обрабатывали элюирующим раствором дважды, добавляя в центрифужные стаканы по 5 мл буфера. Элюаты собирали и концентрировали в ультрафильтрационной ячейке на мембране ПАН-20 ("МИФИЛ", Беларусь) с номинальным мо-лекулярно-массовым пределом задерживания, равным 20 кДа. Оставшийся на мембране белок промывали 50 мМ фосфатным буфером, рН 7.0. Образец каталазы, выделенный из ФКЖ с помощью ГАП, обозначен КАТ(ГАП), а в случае соосаж-денного адсорбента - КАТ(СМ).
Концентрацию белка определяли по методу [17], используя Кумасси G-250 ("Serva", Германия). Спектрофотометрические измерения проводили на приборах Specord M 400 и Specol 211 (Германия), СФ-46 ("ЛОМО", Россия).
Электрофоретическую подвижность белков ФКЖ и образцов каталазы характеризовали методом диск-электрофореза в буферной системе, рН 8.9 в 7%-ном ПААГ (Модель 69, "Reanal", Венгрия).
Спектры кругового дихроизма (КД) образца КАТ(СМ) регистрировали при комнатной температуре в 30%-ном водном растворе глицерина с 10% этанола в кюветах толщиной 0.1 см на спек-трополяриметре Jasco J-20 (Япония) в диапазоне 195-260 нм. Молярную эллиптичность каталазы рассчитывали по формуле:
[9]х = M(±H) S/ÍOdC,
где M - средняя молекулярная масса аминокислотного остатка каталазы печени быка, равная 115 Да, H - разница интенсивности спектров опытного и контрольного образца в см, S - чувствительность прибора, град/см, d - толщина кюветы в см, C - концентрация белка в г/см3. Расчет долей вторичных структур КАТ(СМ) по спектрам КД проводили с помощью компьютерной программы: Bohm G., "CD Spectra Deconvolution, CDNN2.1".
Каталитическую активность каталазы определяли при 30°С в 10 мМ фосфатном буфере, рН 7.4, содержавшем образец фермента и 50 мМ пероксид водорода. Реакцию разложения H2O2
Таблица 1. Влияние сорбентов на активность каталазы P. piceum
Адсорбент Мольное соотношение компонентов Доля связанной каталазы, % Активность каталазы на сорбенте, % Активность каталазы в элюате, %
Песок 53.2 22.1 11.2
Al2O3 (нейтральная) 82.6 64.9 59.2
Гидроксиапатит 100 100 100
Ca3(PO4)2 100 100 94.1
AlPO4 77.2 77.0 65.5
Ca3(PO4)2 + Mg(OH)2 1 : 1 100 100 100
AlPO4 + Ca3(PO4)2 1 : 3 96.5 100 100
Ca3(PO4)2 + Mg3(PO4)2 3 : 1 92.8 96.0 92.3
Ca3(PO4)2 + Mg(OH)2 + Al(OH)3 1 : 3 : 2 100 100 74.3
Ca3(PO4)2 + Mg3(PO4)2 + AlPO4 2 : 2 : 1 87.1 96.2 83.8
Mg(OH)2 + уголь 3.25 : 1 100 91.3 83.8
Ca3(PO4)2 + уголь 1.8 : 1 100 100 100
Ca3(PO4)2 + Mg3(PO4)2 + AlPO4 + уголь 2 : 2 : 1 : 1 82.6 96.4 86.9
начинали, добавляя в среду ее аликвоту. За расходованием H2O2 следили спектрофотометрически на приборе СФ-46 по уменьшению поглощения света при 245 нм. Активность каталазы характеризовали начальными скоростями расходования H2O2 (v0, M c-1), используя при расчетах коэффициент молярной экстинкции H2O2, равный 34.6 M-1 с-1 [11]. Из зави
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.