ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2013, том 60, № 2, с. 230-239
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1:581:575
ОСОБЕННОСТИ АДАПТОГЕННОГО ДЕЙСТВИЯ КОМПЛЕКСА ФЕНИЛПРОПАНОИДОВ НА КУЛЬТУРУ КЛЕТОК ДИОСКОРЕИ В УСЛОВИЯХ АБИОТИЧЕСКОГО СТРЕССА © 2013 г. Л. А. Волкова, В. В. Урманцева, А. Б. Бургутин, А. М. Носов
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева
Российской академии наук, Москва Поступила в редакцию 02.02.2012 г.
На культуре клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) изучали биологическую активность экстракта корней родиолы розовой (Rhodiola rosea L.), содержащего комплекс фенилпро-паноидов (КФП), в норме и в условиях абиотического стресса. Обнаружена высокая радикал-связующая способность КФП по отношению к анион-радикалу кислорода и гидроксил-радикалу. При этом, обладая высоким уровнем антирадикальной защиты, КФП при высоких концентрациях (более 100 мкМ) проявлял прооксидантное действие, вызывая снижение жизнеспособности клеток диоскореи и уменьшение активности изучаемых ферментов антиоксидантного комплекса: суперок-сиддисмутазы, гваякол-зависимой пероксидазы и каталазы, за исключением аскорбат-пероксида-зы. При действии КФП в концентрации 100 мкМ оксидазная (прооксидантная) активность пероксидазы увеличивалась в 3 раза. Использование КФП в низкой концентрации (2 мкМ) не вызывало значительного изменения в уровне активности изучаемых ферментов, а также существенного повышения оксидазной активности пероксидазы. При окислительном стрессе, вызванном действием параквата и высокой температуры, КФП проявлял адаптогенное действие, способствуя повышению выживаемости клеток, однако при гиперосмотическом стрессе он был не эффективен. Наибольшую эффективность КФП проявлял в низкой концентрации после предкультивирования с клетками в течение 5 дней. При этом выявлено повышение количества первичных и вторичных продуктов ПОЛ. Уменьшение времени предкультивирования приводило к снижению защитного эффекта.
Ключевые слова: Dioscorea deltoidea — Rhodiola rosea - корень - культура клеток in vitro —фенилпропа-ноиды — антирадикальные свойства — гиперосмотический стресс — гипертермия — паракват
DOI: 10.7868/S0015330313010107
ВВЕДЕНИЕ
Функционирование и развитие растений в среде, содержащей кислород, не могло бы быть возможным без существования защитных систем, основу которых составляют ферментативные и неферментативные антиоксиданты. Образование прооксидантов в растительных организмах в нормальных условиях и в условиях абиотического стресса уравновешено их дезактивацией антиок-сидантами. Ферменты антиокислительной систе-
Сокращения: АПО - аскорбатпероксидаза; АРА — антирадикальная активность; КАТ - каталаза; КД — конъюгирован-ные диены; КФП — комплекс фенилпропаноидов; ПО - гваякол-зависимая пероксидаза; СОД — супероксиддисмутаза; ТБК-АП — комплекс тиобарбитуровой кислоты и взаимодействующих с ней активных продуктов. Адрес для корреспонденции: Волкова Людмила Александровна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Электронная почта: la-volkova@yandex.ru
мы принимают участие не только в адаптивных реакциях в условиях абиотического стресса, а также в регуляции метаболизма, что особенно важно в обеспечении быстрого приспособления к меняющимся условиям внешней среды [1]. В случае небольшого повышения уровня активных форм кислорода (АФК) ферментативная антиокси-дантная система является наиболее эффективной преимущественно в детоксикации супероксида и перекиси водорода [2]. Однако при чрезмерном возрастании уровня свободных радикалов нередко происходит подавление ферментативного звена в системе защиты клеток. Кроме того, обезвреживание таких АФК, как синглетный кислород, гидроксил-радикал, пероксинитрит, не находится под ферментативным контролем [1-3]. В этих условиях повышается значение низкомолекулярных неферментативных антиоксидантов, среди которых важную роль играют фенольные соединения. Особую значимость фенольные антиокси-
данты приобретают при регулировании медленных окислительных процессов, что обусловлено их способностью обезвреживать разрушительное действие промежуточных продуктов окислительных процессов — органических перекисей и радикалов [4]. Известно также, что фенольные анти-оксиданты служат инактиваторами АФК, в том числе и самого мощного из известных окислителей — гидроксил-радикала [4, 5].
Наряду с антиоксидантным действием фе-нольным соединениям свойственно проявление в определенных условиях выраженных проокси-дантных свойств. Продукты их окисления в виде хинонов обладают высокой токсичностью и проявляют мутагенную и канцерогенную активность [5]. Большую роль в защите от стрессовых факторов среди фенольных соединений играют фенил-пропаноиды, которые широко распространены в растительном мире, но лишь в последнее время стали предметом пристального внимания исследователей. Многие фенольные соединения находят широкое применение в медицинских целях, в частности, фитопрепараты родиолы розовой, основу которых составляет комплекс фенилпропа-ноидов (КФП) [6]. Несмотря на обилие работ, подтверждающих антиоксидантное действие природных фенольных соединений в клетках животных, существуют лишь немногочисленные доказательства проявления их защитного свойства при экзогенном воздействии на растительные клетки [7, 8].
Важным фактором, определяющим устойчивость растений, является эффективность работы сигнальных и регуляторных систем на клеточном уровне, позволяющих организму быстро адаптироваться к стрессовым условиям. Культура клеток in vitro, проявляющая именно клеточный уровень адаптивного ответа, является удобной моделью для изучения защитного действия разных веществ в условиях стресса.
Целью настоящей работы являлось изучение особенностей адаптогенного действия комплекса фенилпропаноидов на культуру клеток диоско-реи дельтовидной в условиях абиотического стресса.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служила суспензионная культура клеток диоскореи дельтовидной (Dioscorea deltoidea Wall) штамма ИФР ДМ 0.5, зарегистрированного во Всероссийской коллекции клеточных культур под № 6. Клетки культивировали на среде МС, содержавшей витамины по Стаба [9], сахарозу (3%), 2,4-Д (1 мг/л) и кинетин (0.1 мг/л). Выращивание культуры клеток проводили в темноте, в колбах на качалке при скорости вращения 95 ± 3 об./мин, температуре 26°С и
влажности воздуха камеры 60-70%. Цикл роста составлял 14 дней. Для анализа использовали суспензию клеток в период с 7 по 12 сутки культивирования.
Препарат КФП был любезно предоставлен проф. А.П. Даскалюком (Кишинев, Институт генетика и физиологии растений Республики Молдова) и представлял собой водно-спиртовой экстракт из корней и корневищ родиолы розовой (Rhodiola rosea L.). Расчет концентраций КФП производили по молекулярной массе розавина в связи с его высоким содержанием в экстракте ро-диолы розовой [6]. КПФ использовали в интервале концентраций от 2 до 2000 мкМ.
Определение антирадикальной активности
(АРА) осуществляли спектрофотометрическим методом, основанным на способности КФП ин-гибировать предварительно генерируемые в модельных условиях in vitro супероксид и ОН* [10]. АРА рассчитывали в % ингибирования супероксида по формуле:
% ингибирования = 100 х (1 — А2/А1),
где А1 — оптическая плотность формазана при длине волны 560 нм без добавления антиоксидан-та, А2 — оптическая плотность формазана после добавления антиоксиданта. Антирадикальную активность выражали в % образования формаза-на от его уровня в реакционной среде (контроль). Эффекты КФП сравнивали с действием аскорбиновой кислоты в эквимолярных концентрациях.
Скорость образования гидроксил-радикала оценивали по степени деструкции дезоксирибозы гидроксильными радикалами, образуемыми в реакции Фентона [11]. Уровень образования ТБК-активных продуктов (ТБК-АП) в результате распада 2-дезокси^-рибозы определяли по методу, описанному в работе [10], и рассчитывали в % от контроля (без КФП).
Определение активности ферментов в клетках диоскореи дельтовидной. После гомогенизации осажденных клеток суспензии (150-200 мг) в 0.1 М калий-фосфатном буфере соответствующего рН (6.8 — для пероксидазы и 7.8 — для СОД) и последующего центрифугирования при 10 000 g в течение 10 мин супернатанты использовали для определения активности ферментов.
Общую активность супероксиддисмутазы (СОД, КФ 1.15.1.11) определяли с использованием нитросинего тетразолия, конкурирующего с СОД за супероксидные анионы, которые возникают в результате взаимодействия метионина и рибофлавина при освещении в течение 30 мин при температуре 25°C [12]. Активность СОД определяли по оптической плотности при 560 нм и выражали в относительных единицах на 1 г сырой массы.
Активность гваякол-зависимой формы пероксидазы (ПО, КФ 1.11.1.7) определяли по изменению оптической плотности при 470 нм реакционной смеси [13]. Активность ПО рассчитывали по количеству окисленного гваякола в мкмоль/г сырой массы мин c учетом коэффициента экстинк-ции (s) = 26.6/(моль см).
"Переключение" пероксидазной активности фермента на оксидазную изучали при действии КФП в концентрации 2 и 100 мкМ на клетки дио-скореи дельтовидной в течение 30 мин. В реакционную среду, содержавшую гваякол, вносили НАД-Н в конечной концентрации 16.6 мкМ и регистрировали активность ПО до и после внесения НАД-Н. Снижение активности ПО вычисляли по формуле:
% снижения = 100 х (1 — А1/А2),
где А1 — активность фермента (мкмоль/г сырой массы мин) после внесения НАД-Н, А2 — исходная, без НАД-Н.
Активность аскорбатпероксидазы (АПО, КФ 1.11.1.11) определяли по снижению оптической плотности при 298 нм в результате окисления аскорбиновой кислоты перекисью водорода [14]. Для каждого определения проводили также контрольное измерение неспецифического окисления аскорбата. Активность фермента выражали в количестве окисленного аскорбата в мкмоль/г сырой массы мин с учетом коэффициента экс-тинкции (s) = 0.80/(моль см).
Активность каталазы (КАТ, КФ 1.11.1.6) определяли по количеству разложившейся перекиси в мкмоль/г сырой массы мин с
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.