НЕЙРОХИМИЯ, 2010, том 27, № 1, с. 40-46
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822:616.895:577.218
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ ТРАНСКРИПЦИОННОГО ФАКТОРА ШЕ-1а В МОЗГЕ КРЫС ПРИ ФОРМИРОВАНИИ ДЕПРЕССИВНОПОДОБНОГО СОСТОЯНИЯ И АНТИДЕПРЕССИВНЫХ ЭФФЕКТОВ ГИПОКСИЧЕСКОГО ПРЕКОНДИЦИОНИРОВАНИЯ
© 2010 г. К. А. Баранова*, В. И. Миронова, Е. А. Рыбникова, М. О. Самойлов
Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург
Методом количественной иммуноцитохимии исследовали динамику экспрессии белка Н1Р-1а в гипоталамусе, гиппокампе и неокортексе крыс при развитии у них депрессивноподобного состояния, а также после применения гипоксического прекондиционирования (ГП), оказывающего выраженное антидепрессивное действие. Впервые установлено, что фактор Н1Р-1а индуцируется в нейронах мозга в ответ на психоэмоциональный стресс, вызывающий развитие экспериментальной депрессии у крыс в модели "выученной беспомощности". В гиппокампе профиль его стресс-индуцированной экспрессии имел двухволновой характер: ранней умеренной экспрессии в 1-е сут и отсроченной — на 10-е сут после стресса. В неокортексе достоверных изменений не регистрировалось, а в гипоталамусе наблюдалось повышение экспрессии Н1Р-1а на отдаленных сроках (5-е—10-е сут). После ГП с использованием трехкратной умеренной гипобарической гипоксии, предотвращающего развитие депрессивноподобного состояния у крыс, выявлена значительная модификации постстрессовой экспрессии белка Н1Р-1а в образованиях мозга. В гиппокампе ГП-крыс пик ранней экспрессии пролонгировался до 5-х сут после стресса и многократно возрастал по амплитуде, а отсроченной — наоборот нивелировался. Аналогичный эффект ГП наблюдался и в гипоталамусе, однако проявлялся слабее. Полученные данные свидетельствуют, что отсроченная экспрессия Н1Р-1а в гиппокампе и гипоталамусе, вероятно, вовлекается в механизмы патогенеза депрессивной патологии. Вместе с тем существенные модификации ранней и поздней постстрессовой экспрессии Н1Р-1а, вызываемые ГП, очевидно, играют важную роль в повышении устойчивости мозга к тяжелым стрессам и защите от развития стрессиндуцированных депрессивных патологий.
Ключевые слова: И№-1а, гипоксическое прекондиционирование, психоэмоциональный стресс, депрессивные состояния, нейропротекция.
ВВЕДЕНИЕ
HIF-1 (Hypoxia-inducible factor-1) — это транскрипционный фактор, впервые обнаруженный в клетках Hep3B при гипоксии [1]. В настоящее время он считается ведущим регулятором транскрипции генов, ответственных за реакцию на недостаток кислорода. HIF-1 — гетеродимерный редокс-чувствительный белок, состоящий из ин-дуцибельной кислородчувствительной субъединицы HIF-1a и конститутивно экспрессируемой субъединицы HIF-1p. Обе субъединицы HIF-1 являются основными белками, содержащими домен "спираль—поворот—спираль" (HLH) и PAS домен, что определяет их принадлежность к большому семейству димерных эукариотических факторов транскрипции, в которых домен HLH отвечает за димеризацию, связывание с ДНК и взаимодействие с РНК-полимеразой [2, 3].
*Адресат для корреспонденции: 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6; тел. 8(911)234-54-53; e-mail: ksentippa@mail.ru
Концентрация Н1Р-1а в нормоксических условиях поддерживается на низком уровне благодаря кислородзависимому гидроксилированию, приводящему к деградации этой субъединицы в протеасо-ме. При гипоксии пролил-гидроксилазные реакции ингибируются, Н1Р-1а димеризуется в ядре с Н1Р-1р, и этот комплекс активирует транскрипцию генов-мишеней [4, 5]. Важную роль в индукции и регуляции Н1Р-1 играют также кислород-независимые механизмы. В частности, на активность Н1Р влияют факторы роста [6, 7], онкогены [8, 9], белки теплового шока [10—12], каскады киназ МАРК, РВК/АЫ, РКС [6, 12—14] и ДНК-зависимой проте-инкиназы [15]. Показано влияние оксида азота N0 [16], а также активных форм кислорода на повышение содержания Н1Р-1а [17, 18]. Обнаружено, что Н1Р-1а взаимодействует с глюкокортикоидными рецепторами, и его активность может регулироваться глюкокортикоидными гормонами [19, 20]. Однако до сих пор пути кислород-независимой активации Н1Р остаются во многом невыясненными.
Н1Р-1 обеспечивает быстрые адаптивные ответы на гипоксический стресс и иные повреждающие воздействия. Активируя гены, регулирующие процесс ангиогенеза, вазомоторный контроль, энергетический и ионный метаболизм, эритропо-эз и апоптоз, а также гены некоторых других транскрипционных и ростовых факторов [21—23], Н1Б-1 мобилизует механизмы предотвращения нарушения кислородного гомеостаза, а также ней-ропластичности и нейропротекции. Индукция этих протективных механизмов мозга может быть вызвана применением немедикаментозного способа гипоксического прекондиционирования (ГП). ГП — это воздействие краткими эпизодами умеренной гипоксии, приводящее к повышению устойчивости мозга к неблагоприятным факторам. Нами установлено, что трехкратное прекондицио-нирование умеренной гипобарической гипоксией защищает нейроны мозга, предотвращая их структурные и функциональные повреждения при тяжелой гипоксии [24, 25]. Оказалось, что наряду с общим нейропротективным действием ГП оказывает выраженный антидепрессивный эффект, предотвращая формирование депрессивных состояний, вызываемых тяжелыми формами психоэмоционального стресса [26—29].
Цель настоящей работы — изучение изменений экспрессии Н1Б-1а в мозге после аверсивного стресса у непрекондиционированных крыс, формирующих постстрессовые депрессивные патологии, а также у прекондиционированных животных, у которых депрессивноподобные состояния в этих же условиях не развиваются. Иммунореактивность к Н1Б-1а исследовали в областях мозга, играющих ключевую роль в регуляции стрессорных реакций и обеспечении адаптивного ответа — гипоталамусе, гиппокампе и неокортексе.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Эксперименты выполнены на 54 лабораторных крысах линии Вистар с массой тела 180—250 г, разделенных на три равные группы. Крыс первой группы подвергали неконтролируемому неизбега-емому стрессу в классической парадигме "выученной беспомощности", приводящему к развитию депрессивноподобного состояния [30]. Неизбегае-мый стресс вызывали аверсивным воздействием, стимулируя крыс электрическим током (1 мА, 1 Гц, 15 с) в замкнутом пространстве клетки размерами 13 х 16 х 26 см с токопроводящим полом с использованием интервала разной длительности между подачей тока на пол камеры так, чтобы каждая крыса в течение часа получила по 60 стимуляций. Это приводило к развитию у них стойкого депрессивно-подобного состояния, как это было показано нами ранее с помощью классических тестов изучения поведения, гормональных тестов функции ГАС и теста с использованием антидепрессанта [26, 27]. Живот-
ных второй группы перед стрессирующим воздействием подвергали гипоксическому прекондицио-нированию (ГП), которое предотвращало развитие у них депрессивноподобного состояния [27—29]. Ги-поксическое прекондиционирование с использованием умеренной интервальной гипобарической гипоксии осуществляли путем трехкратных гипо-барических сеансов в модели, разработанной и описанной нами ранее [31]. Экспериментальных животных в специальной барокамере проточного типа "поднимали" на условную высоту 5 км над уровнем моря (давление в камере 360 мм рт. ст.) на 2 ч ежедневно в течение 3 дней с интервалом 24 ч, последнее прекондиционирующее воздействие проводилось за 24 ч до стрессирования. Третью группу крыс составляли контрольные животные, их помещали в те же клетки при отсутствии гипоксии и электрического раздражения. Спустя 1, 5 и 10 сут после стрессорного воздействия по 6 крыс из каждой группы декапитировали. Мозг быстро извлекали, выделяли области гиппокампа с прилежащей фронтопариетальной корой и область гипоталамуса. Выделенные области фиксировали 4%-ным раствором параформальдегида. Далее препараты подвергали стандартным процедурам промывки, обезвоживания и проведения через порции ксилола и парафина. Затем материал заливали в парафиновые блоки. Далее при помощи микротома изготавливали серии чередующихся срезов мозга во фронтальной плоскости толщиной 7 мкм на уровне —2.80 мм от брегмы [32]. Они использовались для количественной иммуноцитохи-мической оценки содержания белка — продукта раннего гена HIF-1a в нескольких областях мозга крыс: гипоталамус (крупноклеточное и мелкоклеточное паравентрикулярное ядро — PVNm, PVNp; супраоптическое ядро), неокортекс (V слой), дор-зальный (СА1) и вентральный (зубчатая извилина — DG) гиппокамп. После стандартных процедур депа-рафинизации, регидратации и демаскировки антигена срезы в течение ночи при +4°C инкубировали с первичными поликлональными кроличьими антителами к HIF-1a (Santa Cruz Biotechnology, Inc, USA, разв. 1 : 100), а далее использовали авидин-биотиновую систему детекции (Vector Laboratories, Inc, UK). Для визуализации реакции использовали диаминобензидин. После обезвоживания и заключения срезов в желатин проводили количественный анализ иммунореактивности нейронов с использованием системы, состоящей из светового микроскопа Jenaval (Carl Zeiss, Germany), цифровой камеры Baumer CX05c (Baumer Optronic, Germany) и компьютера IBM PC с программным обеспечением Videotest Master Morphology. На основании оценки оптической плотности иммунопозитивные клетки разделяли на два класса: слабо- и сильно-иммуно-реактивные, анализировали общее число иммуно-реактивных клеток (N) и число сильнореактивных клеток (Ni). Для каждого животного анализировали
%
150 120 90 60 30
0
%
250 200 150 100 50
0
%
120 90 60 30 0
N
N
N
А
ш
Б
*
- * * * иг
%
1200 900 600 300
0
%
2000 1600 1200 800 400 0
В
%
t 400 -300 -
Ni
* *
* и . — * 1 И+1.
Ni
*
Ni
kJLi
1 сутки 5 сутки 10 сутки 1 сутки 5 сутки 10 сутки
Рис. 1. Изменения экспрессии НШ-1а в гиппокампе (А — область СА1, Б — зубчатая извилина) и неокортексе (В) не-и прекондиционированных крыс после неизбегаемого стресса в парадигме "выученная беспомощность". Темные столбики — непрекондиционированные животные, формирующие пост-стрессовое депрессивное состояние; светлые столбики — крысы, подвергнутые ГП и не формирующие пост-стрессовое депрессивное состояние;
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.