ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 3, с. 429-434
УДК 581.1
ОСОБЕННОСТИ ИЗОФЕРМЕНТНЫХ СПЕКТРОВ АНИОННЫХ ПЕРОКСИДАЗ И СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ В КАЛЛУСНОЙ КУЛЬТУРЕ Ьапх БМтеа ЬейеЬ. И Ьапх gmelinii Иирг. Иирг.
© 2004 г. Е. Ю. Гарник, Е. В. Лазарева, Ю. М. Константинов
Сибирский институт физиологии и биохимии растений Сибирского отделения Российской академии наук,
Иркутск Поступила в редакцию 31.03.2003 г.
Исследовали спектры молекулярных форм анионных пероксидаз и супероксиддисмутазы (СОД) каллусных линий Ь. sibirica Ledeb. и Ь. gmelinii Яцрг. Яцрг. Среди 13 исследованных линий наблюдали восемь различных типов спектров молекулярных форм анионных пероксидаз. Спектры молекулярных форм супероксиддисмутазы были одинаковы для всех исследованных линий, несмотря на принадлежность линий к двум разным видам и различное происхождение каллуса. Впервые описано присутствие железосодержащей СОД в изоферментном спектре лиственницы. Сделан вывод о большей (по сравнению с изопероксидазными спектрами) стабильности изоферментного состава СОД в дедифференцированных клетках Ь. sibirica и Ь. gmelinii.
Ьапх sibirica - Ьапх gmelinii - каллусная культура - анионные пероксидазы - супероксиддисмутаза -множественные молекулярные формы
Реализация программ развития растительного организма происходит в условиях постоянного действия тех или иных факторов абиотического и биотического стрессов [1, 2]. Предупреждение или устранение отрицательных последствий действия стрессовых факторов на организм обеспечивается системой антиоксидантной защиты, в том числе рядом антиоксидантных ферментов. О характере антиоксидантного ответа растительной клетки обычно судят по изменениям активности нескольких ферментов, осуществляющих детоксификацию различных типов активных форм кислорода (АФК) [3-7].
К числу важнейших ферментов антиоксидантной защиты относятся супероксиддисмутаза (СОД; супероксид: супероксидоксидоредуктаза, КФ 1.15.1.1) и пероксидаза (оксидоредуктаза, КФ 1.11.1.7). В последние годы активно развиваются представления об участии этих ферментов в регуляторных процессах, в частности, в передаче сигналов, обеспечивающих формирование регуля-торного ответа растительной клетки на действие разнообразных факторов среды [8, стр. 173, 182].
Растительная пероксидаза - полифункциональный фермент, обладающий высоким поли-
Адрес для корреспонденции: Гарник Елена Юрьевна. 664033 Иркутск, ул. Лермонтова, 132, а/я 1243. Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН. Факс: (395-2) 51-07-54; электронная почта: garnik@sifibr.irk.ru
морфизмом [9]. Число изоформ пероксидазы у растений может достигать нескольких десятков, но в отдельных тканях, как правило, экспрессиру-ется определенная комбинация из 3-10 изоформ [10]. Супероксиддисмутазы делят на три класса в зависимости от металла-кофактора. Растительные клетки могут содержать супероксиддисмута-зы всех трех классов (марганец-, медь/цинк- и железосодержащие СОД) [2]. Любой класс СОД может быть представлен несколькими, иногда ткане- или органоспецифичными изоформами [11-13].
В рамках данного исследования наибольшее значение для нас имело то, что пероксидаза и супероксиддисмутаза растений значительно различаются как по уровню изоферментного полиморфизма, так и по способности образовывать тканеспецифичные спектры множественных молекулярных форм.
Дифференциальная экспрессия генов в различных условиях окружающей среды приводит к тому, что набор изоферментов той или иной ткани растения может варьировать (в границах, определяемых видом растения) в зависимости от возраста этой ткани [3, 4, 11] и от условий, в которых находятся клетки этой ткани [5-7, 14]. Растительная клетка содержит информацию обо всех возможных для данного вида паттернах экспрессии генов ферментов, обладающих множественными молекулярными формами. Если культура растительных клеток, поддерживаемая в виде каллусных линий, находится в стандартизован-
Характеристики использованных каллусных линий
Линия Тип экспланта Вид Ферменты
C1 Зародыш семени L. sibirica Пероксидаза
C2 Зародыш семени L. sibirica Пероксидаза
C3 Зародыш семени L. sibirica Пероксидаза, СОД
C4 Зародыш семени L. sibirica Пероксидаза
C5 Зародыш семени L. sibirica СОД
Д1* Ауксибласт L. gmelinii Пероксидаза
Д2* Ауксибласт L. gmelinii Пероксидаза
Д3** Ауксибласт L. gmelinii Пероксидаза, СОД
Д4** Ауксибласт L. gmelinii Пероксидаза, СОД
Д5** Ауксибласт L. gmelinii Пероксидаза, СОД
Д6 Зародыш семени L. gmelinii Пероксидаза
Д7 Зародыш семени L. gmelinii Пероксидаза
Д8 Зародыш семени L. gmelinii СОД
Примечание. Линии 3, 4, 9, 13 и 18 получены из камбия ауксибластов деревьев двух удаленных друг от друга популяций Ь. gmelinii.
* Линии, полученные от деревьев первой популяции. ** Линии, полученные от деревьев второй популяции.
ных условиях минерального питания, освещения, температуры, влажности и т.п., то внешние условия жизнедеятельности дедифференцированных, т.е. физиологически однородных, клеток такой культуры будут одинаковы. Тем не менее, работая с каллусной культурой, невозможно предсказать точно, какой конкретный набор генов будет экспрессироваться после дедифференциации клеток [15].
Целью настоящей работы было исследование особенностей спектров множественных молекулярных форм анионных пероксидаз и супероксид-дисмутазы в каллусной культуре сибирских видов лиственницы (Larix sibirica Ledeb. и Larix gmelinii Rupr. Rupr).
МЕТОДИКА
В экспериментах использовали пять каллусных линий L. sibirica Ledeb. и восемь каллусных линий L. gmelinii Rupr. Rupr. Все линии L. sibirica, а так же линии Д6-Д8 L. gmelinii были получены из зародышей семян, любезно предоставленных сотрудниками Иркутской областной лесосемен-ной станции (семена L. sibirica) и Аргунского лесхоза Читинской области (семена L. gmelinii). Линии Д1-Д5 получены из ауксибластов деревьев двух удаленных друг от друга популяций L. gmelinii (таблица).
Каллусную культуру поддерживали на агари-зованной среде следующего состава: минеральные соли по Murashige и Skoog ("ICN", США) [16] -половинный состав, сахароза ("Мосреактив", Россия) - 30 г/л, мезо-инозитол ("Sigma", США) -
80 мг/л, тиамин ("Дальхимфарм", Россия) - 1 мг/л, нафтилуксусная кислота ("Sigma") - 1 мг/л, бензо-аминопурин ("Sigma") - 0.2 мг/л. Культуру выращивали в освещенном термостатируемом боксе при температуре 25°C при интенсивности освещения 1000 лк и продолжительности освещения 16 ч. Продолжительность одного цикла субкультивирования каллусов составляла 28 сут.
Навеску каллуса массой от 300 до 800 мг помещали в охлажденную ступку, замораживали жидким азотом и растирали пестиком до порошкообразного состояния. К измельченному материалу добавляли буфер экстракции следующего состава: 100 мМ KH2PO4 ("Реахим", Россия) рН 7.8, 0.1 мМ ЭДТА ("ICN"), 1 мМ фенилметансульфо-нилфторид ("Boehringer Mannhem", Германия), 14 мкМ 2-меркаптоэтанол ("Ferak", Германия), 4% поливинилпирролидон ("Sigma"), 750 мМ КС1 ("Реахим"), 2 мг/мл целлюлазы из Trichoderma virde (16000 ед./г, "ICN"), соотношение массы каллуса к объему буфера 1 : 2. Гомогенат помещали в термостат и инкубировали при 30°C в течение 1 ч, добавляли Тритон Х-100 ("Ferak") до конечной концентрации 0.3% и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре на шейкере "MS1" ("MLW", Германия), после чего центрифугировали при 12000 g в течение 10 мин на центрифуге EBA 12 ("Hettich", Германия). Су-пернатант диализовали против 200-кратного объема охлажденного 50 мМ KH2PO4 (рН 7.4) в течение 1 ч. По окончании диализа образцы делили на аликвоты и хранили при -20°C. Хранение при этой температуре не вызывало изменений изо-ферментных спектров пероксидазы в течение
(а) (б)
г»
If Щ
>
ш
II
III
У
C1 C2 C3 C4 Д1 Д2 Д3 Д4 Д5 Д6 Д7
C1 C2 C3 C4 Д1 Д2 Д3 Д4 Д5 Д6 Д7
Рис. 1. Фотографии (а) и схематическое изображение (б) спектров множественных молекулярных форм анионных пе-роксидаз каллусных линий Ь. ¡Штеа и Ь. gmelinii. 1-Ш - зоны активности (пояснения в тексте).
двух недель, супероксиддисмутазы - в течение по крайней мере шести недель.
Электрофоретическое разделение белков вели в неденатурирующих условиях в 10% поли-акриламидном геле в системе Davis [17]. Использовали вертикальные блоки полиакриламидного геля (150 х 150 х 1 мм). Разделение проводили в аппарате для вертикального гель-электрофореза VE-4M (производство ООО "Хеликон", Москва).
Определение активности анионных перокси-даз в полиакриламидном геле проводили по методу Graham [18] с использованием солянокислого 3,3-диаминобензидина ("ICN") в цитрат-фосфатном буфере, рН 5.5 (лимонная кислота и дигидро-фосфат натрия - "Реахим"). Гели после электро-форетического разделения белков промывали в цитрат-фосфатном буфере в течение 10 мин, затем инкубировали в растворе, содержащем 0.05% 3.3-диаминобензидина и 0.2% Н2О2 ("Реахим"). Наблюдали постепенное проявление темно-коричневых полос на фоне бесцветного геля. После окрашивания гели промывали цитрат-фосфатным буфером, помещали на стеклянную пластинку, накрывали прозрачной пленкой для принтеров, удаляли пузырьки воздуха, помещали в сканер для непрозрачных объектов MUSTEK 600 CU ("Mustek", Германия), накрывали листом белой бумаги и сканировали с использованием программы Adobe Photoshop 5.5.
Определение активности СОД в полиакриламидном геле проводили методом Beauchamp и Fri-dovich [19] с незначительными модификациями. В качестве катализатора восстановления нитроси-
него тетразолия ("Sigma") использовали феназин-метосульфат ("Sigma") в концентрации 30 мкМ. Для ингибиторного анализа молекулярных форм СОД использовали цианид калия ("Sigma") в концентрации 3 мМ и перекись водорода в концентрации 3 мМ. Обработку ингибиторами проводили в течение 30 мин перед обработкой окрашивающими реагентами. После обработки KCN остаются активными только марганец- и железосодержащие изоформы СОД, после обработки Н2О2 - только марганецсодержащие изоформы. Окрашенные гели промывали дистиллированной водой и сканировали, как описано выше.
Зимографический анализ проводили в трех и более повторностях.
РЕЗУЛЬТАТЫ
В настоящей работе мы и
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.