НЕЙРОХИМИЯ, 2008, том 25, № 3, с. 217-221
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 577.17.08+577.171.4
ОСОБЕННОСТИ КАТАБОЛИЗМА МЕЛАТОНИНА У ЦЫПЛЯТ
© 2008 г. С. В. Розов*
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург
Мелатонин - нейрогормон, вырабатываемый эпифизом и сетчаткой и участвующий в синхронизации биологических ритмов. Исследовалась возможность его катаболизма у цыплят (Gallus gallus) с образованием кинурениновых продуктов - К-ацетил-К-формил-5-метоксикинуренамина (АФМК) и N-ацетил-З-метоксикинуренамина (АМК). Анализ проводился в образцах сыворотки крови, а также сетчатке и эпифизе с использованием ВЭЖХ с флюориметрическим и электрохимическим детектированием. Были выявлены значительные количества мелатонина, присутствующего в эпифизе и сетчатке, а также в сыворотке крови, однако эндогенные АФМК и АМК в этих тканях обнаружены не были. Тем не менее при внутрибрюшинном введении мелатонина в дозе 10 мг/кг эти соединения легко определялись в сыворотке, а АМК - также в сетчатке цыплят. При исследовании фармакодинамики АФМК и АМК в сыворотке их максимальное содержание составляло 4.8 и 2 нг/мл соответственно и регистрировалось для АФМК менее чем через 5 мин и для АМК - через 20 мин после инъекции мелатонина. В сетчатке количество АМК достигало максимума (60 пг/сет-чатку) также через 20 мин. В сетчатке и сыворотке уровень обоих веществ снижался до предела детектирования в течение часа. Таким образом, в организме цыплят мелатонин может окисляться по кинурениновому пути, при этом продукты его окисления АФМК и АМК имеют малое время полураспада. Суммарное количество обоих веществ при введении мелатонина составляло около 0.04% его количества, содержащегося в сыворотке и сетчатке, то есть этот путь окисления мелатонина у цыплят не является основным.
Ключевые слова: мелатонин, кинуренамины, метаболизм, цыплята, Gallus.
ВВЕДЕНИЕ
Мелатонин - одно из наиболее эволюционно древних соединений, описанное практически во всех типах живых организмов - от одноклеточных до млекопитающих [1]. У высших позвоночных основным местом синтеза мелатонина является эпифиз, однако его образование показано также в сетчатке и других тканях [2-4]. Функции мелатонина состоят в регуляции физиологических процессов, связанных с суточными и сезонными ритмами, иммуномодулирующем и цито-протекторном эффектах и проч. [5-7]. Синтез его контролируется в основном центральным цирка-дианным осциллятором и имеет циклический характер с максимумом в середину темной фазы суток [6], но помимо этого в регуляции уровня мелатонина в крови и тканях участвуют и системы распада.
Основным путем деградации мелатонина является его гидроксилирование цитохромами Р450 печени [8, 9] с образованием 6-гидроксимелатонина, который в виде конъюгатов с сульфатом или глю-куронидом выводится с мочой. Тем не менее, этот путь не является единственным. В качестве альтернативы рассматриваются кинурениновые про-
* Адресат для корреспонденции: 194223, Санкт-Петербург, пр. М. Тореза, 44; тел. 552-31-96; факс: 552-30-12; e-mail: stanislav_rozov@mail.ru
дукты, К-ацетил-К-формил-5 -метоксикинурена-мин (АФМК) и К-ацетил-5-метоксикинуренамин (АМК), образующиеся при разрыве пиррольного кольца и последующем деформилировании мелатонина. Подобный путь является основным в метаболизме предшественника и структурно родственного мелатонину соединения - триптофана [10].
Одним из путей образования АФМК и АМК является взаимодействие мелатонина с активными формами кислорода [11, 12], другим - его окисление индоламин-2,3-диоксигеназой или ми-елопероксидазой, идущее с образованием АФМК и последующее деформилирование формамида-зой или каталазой до АМК [11, 13, 14]. Эти механизмы окисления мелатонина были показаны in vitro, а также ex vivo - на культурах активированных нейтрофилов и макрофагов [15, 16]. У некоторых одноклеточных и растений кинуренино-вый путь распада мелатонина связан, вероятно, с его антиокислительными эффектами [1, 17]. Недавно возможность распада экзогенного мелатонина с образованием АФМК и АМК была продемонстрирована на крысах и мышах [18, 19].
Стоит отметить, что исследования такого рода проводились исключительно на млекопитающих, у птиц же наличие этого пути распада не исследовалось. Между тем, существуют различия в метаболизме мелатонина у этих классов высших позвоночных. Так, количество мелатонина, выраба-
тываемое сетчаткой птиц в пересчете на единицу веса, в несколько раз превосходит млекопитающих и сопоставимо с эпифизом [20]. Кроме того, у всех позвоночных, кроме млекопитающих, описана система его локальной деградации в сетчатке с образованием 5-метокситриптофола и 5-мет-оксииндолуксусной кислоты [21].
В настоящей работе проверялось, существует ли возможность распада мелатонина с образованием кинурениновых продуктов у птиц на примере Gallus gallus, как на уровне организма, так и в местах его синтеза - в эпифизе и сетчатке.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Животные. Исследования проводились на цыплятах-самцах (Gallus gallus, порода White Leghorn), возраст 2 нед. Корм и воду животные получали ad libitum, освещение на дне клеток в световую фазу цикла составляло 300 люкс, температура в помещении 18-23°С. К моменту эксперимента после 2 недель акклимации к инвертированному ритму цикла свет/темнота (l2/12; фотофаза 21.00-09.00) вес животных составлял 170 ± 15 г.
Реактивы. Мелатонин и 30% H2O2 приобретены в Sigma (St. Louise, США) для синтеза АФМК. Хлористый метилен (НеваРеактив, Россия), метанол (Fisher Co., США) и газообразный азот (AirGas, США) использовали при экстракции; ацето-нитрил (Криохром, Россия), H3PO4 и K2HPO4 (Fisher Co., США) - как компоненты подвижной фазы для ВЭЖХ. Стандарт АФМК синтезирован и очищен нами, как описано далее, стандарт АМК любезно предоставлен лабораторией проф. Rus-sel J. Reiter (унив. штата Техас, США). Дополнительную деионизацию и ультрафильтрацию дистиллированной воды проводили на установке Millipore (Bedford, США). Все реактивы имели квалификацию степени очистки не ниже ХЧ/HPLC grade, если не оговорено иное.
Синтез и анализ АФМК. Реакционная смесь состояла из 30% водного раствора H2O2, и спиртового раствора мелатонина. Реакция возможна только в присутствии кислорода [22, 23], поэтому инкубационную смесь не деаэрировали. Мелатонин предварительно растворялся в 5%-ном метаноле в концентрации 10 мМ, затем необходимое количество его маточного раствора смешивалось с H2O2 до достижения конечной концентрации 1 мМ. Инкубация проводилась в темноте, при температуре 20 ± 2°С.
Для идентификации синтезированного соединения проводился анализ спектра его поглощения в диапазоне длин волн 190-700 нм с использованием спектрофотометра Specord M-40 (Carl Zeiss, Германия), а также флюоресценции в диапазоне длин волн эмиссии 350-700 нм при длине волны
возбуждения 340 нм при помощи спектрофлюо-риметра RF-1501 (Shimadzu, Япония). Для установления молекулярной массы использовался масс-спектрометрический анализ с прямым вводом пробы и ионизацией электронным ударом (энергия 70 эВ) на спектрометре МХ-1303 (Россия). По результатам спектрометрических исследований образующееся соединение имеет максимумы экстинкции и эмиссии 340 и 480 нм, соответственно. Отношение m/z для молекулярного иона составило 264 [(M)+, 30%], другие фрагменты: 192 [(M-72)+, 50%], 178 [(M-88)+, 100%] и 150 [(M-114)+, 50%]. На основании сопоставления полученных данных с литературными [24] был сделан вывод об идентичности синтезированного соединения АФМК.
Определение АФМК и АМК в сыворотке крови, сетчатке и эпифизе цыплят и изучение их фармакодинамики. В контрольной группе цыплят (без инъекции мелатонина) 18 эпифизов были отобраны в середине темновой фазы цикла и заморожены при -85°C. Перед анализом 18 проб объединялись в одну и гомогенизировались в 0.2 Н HClO4 для осаждения белков.
Кровь и сетчатки отбирались как в группе животных, не инъецированной мелатонином, так и в группе с введенным внутрибрюшинно мелатонином в дозе 10 мг/кг. Мелатонин (2.5 мг) предварительно растворялся в 1 мл 5%-ного этанола (об./об.). Отбор проб в опытных и контрольных группах животных производился через 5, 10, 20, 30 и 60 мин после инъекции. Перед анализом 3 сетчатки объединялись в одну пробу и гомогенизировались при +4°C в 800 цл 66 yM р-ра калий-фосфатного буфера (pH 7.4). Кровь отбиралась в стеклянные пробирки и инкубировалась при +4°C до образования сгустка. Пробы крови центрифугировались 10 мин при 2200 g, сыворотка отбиралась и хранилась при -85°C.
Пробы сетчаток и эпифизов центрифугировались 10 мин при 15000 g при +4°C, и осторожно отбиралась верхняя фаза, из которой проводилась твердофазная экстракция АФМК и АМК с использованием картриджей (J.T. Baker, США) с неполярной С18-привитой фазой. Сыворотка (500 мкл) наносилась на картриджи без предварительной обработки. Картриджи прекондициони-ровались 1 + 1 мл абсолютного метанола и 1 + 1 мл воды, наносились пробы исследуемого материала и проводилась экстракция. По окончании экстракции картриджи повторно промывались 1 мл 7%-ного метанола, затем 300 + 300 мкл абсолютного метанола. Элюат отбирался в стеклянные пробирки и высушивался под током азота. Сухой остаток ресуспендировался в 100 мкл мобильной фазы для ВЭЖХ (17.5% ацетонитрил и 82.5% 50 мМ калий-фосфатного буфера (pH7) (об./об.)), повторно центрифугировался 4 мин при 15000 g
mAU 220
200
180
160
140
120
100
80 0
мелатонин
200
400
600
800
1000
1200 t, сек
Хроматограммы пробы, объединенной из 18 эпифизов в сравнении со стандартами АМК и мелатонина (потенциал рабочего электрода 0.45 В; пики АМК и мелатонина соответствуют 232 пг и 1 нг соответственно).
при +4°C для осаждения микрочастиц и 75 мкл полученного раствора анализировалось хромато-графически.
ВЭЖХ-анализ АФМК проводился с использованием системы Agilent Technologies 1100 series (Agilent Technologies, USA) с флюориметриче-ским детектором с A,ex = 280 нм, A,em = 340 нм для мелатонина и A,ex = 340 нм, A,em = 480 нм для АФМК. Для определения АМК применялся электрохимический детектор ESA Coulochem III с аналитической кулономет
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.