=ЗООЛОГИЯ =
УДК 595.121
ОСОБЕННОСТИ ЛОКАЛИЗАЦИИ ПРОСТАГЛАНДИНА
E2, y-АМИНОМАСЛЯНОЙ кислоты и других потенциальных
ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ У ПЛЕРОЦЕРКОИДА Diphyllobothrium dendriticum (Cestoda) © 2014 г. Н. М. Бисерова*, И. А. Кутырев**
* Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, биологический ф-т, 119991 Москва, Ленинские горы ** Институт общей и экспериментальной биологии СО РАН, 670047 Улан-Удэ, ул. Сахьяновой, 6 E-mail: sankaar@mail.ru Поступила в редакцию 17.04.2013 г.
Впервые выявлены потенциальные иммуномодуляторы — простагландин Е2 и у-аминомасляная кислота (ГАМК) у плероцеркоида Diphyllobothrium dendriticum, паразитирующего в тканях и брюшной полости байкальского омуля Coregonus migratorius. Локализация иммуномодуляторов в тканях паразита сопоставлена с локализацией типичных маркеров нервной системы (серотонином (5-НТ) и FMRF-амидом), а также маркером микротрубочек — а-тубулином. В клетках, иммунореактивных по отношению к а-тубулину и расположенных в кортикальной паренхиме вне центральной нервной системы (ЦНС), выявлен простагландин Е2. Предположено, что простагландин Е2 вырабатывается фронтальными железами и выносится на поверхность тегумента через специализированные протоки. В центральной и в периферической нервной системах выявлена иммунореакция на ГАМК. В церебральном ганглии и главных нервных стволах обнаружены тела ГАМК-ергических нейронов, нейриты которых образуют сеть на поверхности мышечных слоев и в субтегументе. Описаны морфологические признаки для идентификации серотонинергических нейронов в ЦНС.
DOI: 10.7868/S0002332914030023
Способность паразитических червей регулировать иммунный ответ своего хозяина позволяет им существовать в организме хозяина длительное время. К основным механизмам уклонения паразитических животных от иммунного ответа хозяев относятся антигенная мимикрия, иммуносу-прессия (Sitja'-Bobadilla, 2008), иммуномодуля-ция (Harnett, Harnett, 2008) и многие другие.
Наиболее вероятный путь модуляции иммунной системы хозяина —секреция паразитом растворимых медиаторов, которые связываются, разрушают или иным образом взаимодействуют с иммунокомпетентными клетками и молекулами. К настоящему времени изучен широкий спектр выделяемых гельминтами млекопитающих веществ, которые играют роль иммунорегуляторов в организме хозяина (Hewitson et al., 2009), тогда как у гельминтов рыб способность синтезировать и выделять иммунорегуляторные молекулы практически не изучена.
Простагландины (PG) представляют собой группу синтезируемых паразитами структурно взаимосвязанных биоактивных липидных медиаторов, вовлеченных в развитие разнообразных симптомов, сопровождающих паразитозы. В частности, PG являются одним из важных клас-
сов иммуномодуляторов (Hewitson г1 а1., 2009). Установлено, что РО Е2 снижает продукцию ци-токинов. И хотя он был выявлен у представителей паразитических простейших, трематод и нематод (Kubata а1., 2007), механизмы регуляции иммунной системы хозяев простагландинами паразитов мало изучены, а сведения о наличии и функционировании РО в организме цестод отсутствуют.
Кроме РО иммуномодулирующее действие способны оказывать нейромедиаторы (Kawli вta/., 2010). В отсутствие кровеносной системы нейроны цестод секретируют гормоноподобные субстанции, нейропептиды и другие биологически активные молекулы широкого спектра действия (Накоп, Оustaisson, 1996), в том числе обнаруженные в нервной системе В1рНу11оЬоЛг1ит dвndriti-сит (Gustafsson вt а1., 1986). Защиту от иммунного ответа хозяина часто связывают с высокой секреторной активностью покровов цестод (Куперман, 1988). Кроме того, у большинства цестод имеются специализированные фронтальные железы, работающие под контролем нервной системы (Ки-perman, Davydov, 1982а, б; Давыдов, Бисерова, 1985; Бисерова, Кемаева, 2012). Предполагается, что эти железы выполняют адгезивную или имму-
нозащитную функцию. Сведений о химическом составе секрета фронтальных желез в литературе нет.
Цель исследования — выявление у плероцер-коида D. dendriticum потенциальных иммуномо-дуляторов PG E2 и у-аминомасляной кислоты (ГАМК) и сопоставление их локализации с локализацией маркеров нервной системы: серотонина (5-HT) и FMRF-амида, а также маркера микротрубочек — ацетилированного тубулина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материал был собран в 2010 г. в бассейне оз. Байкал, где зараженность байкальского омуля плероцеркоидами D. dendriticum достигает 70— 100% (Русинек, 2007). Живых плероцеркоидов D. dendriticum выделяли из полости тела омуля.
Фиксация. Материал фиксировали в 4%-ном параформе на 0.1 М фосфатном буфере (PBS), pH 7.4 (3 ч), отмывали в 0.1 М PBS (3 раза по 15 мин) и помещали в 10%-ный раствор сахарозы на 0.1 М PBS (6 ч). Часть плероцеркоидов не фиксировали, а сразу после выделения замораживали в жидком азоте для определения PG Е2. Перед резкой объекты помещали в криопротектор Tissue-Tek (Sakura Finetek, США), после чего резали на криотоме Leica CM 1850 UV (Германия). Срезы (8—10 мкм) помещали на предметные стекла с по-ли^-лизином. Для выявления PG Е2 срезы фиксировали в абсолютном ацетоне (5 мин), затем подсушивали и хранили в замороженном виде.
Иммуноокрашивание. Срезы обрабатывали 1%-ным раствором Triton X-100 (США) на 0.01 М PBS (2 раза по 15 мин), преинкубировали в растворе 1%-ного бычьего сывороточного альбумина (BSA) с добавлением 1%-ного Triton X-100 на 0.01 М PBS (1 ч). В течение суток при 4°С проводили инкубацию с моноклональными антителами к PG E2 (Abcam, Великобритания), 5-HT, ГАМК, FMRF-амидам, а-тубулину (Sigma, США). Использовали следующие сочетания антител, разведенных на 0.01 M PBS с добавлением 1%-ного Triton X-100, 1%-ного BSA и 0.03%-ного NaNO3:
анти-PG E2 из кролика (1 : 125) и анти-а-тубу-лин из мыши (1 : 1000);
анти-ГАМК из мыши (1 : 200) и анти-FMRF-амид из кролика (1 : 5000);
анти-ГАМК из мыши (1 : 200) и анти-5-HT (се-ротонин) из кролика (1 : 7000);
анти-5-HT (серотонин) из кролика (1 : 7000) и анти-а-тубулин из мыши (1 : 1000).
В качестве вторичных антител использовали Alexa 405, 488, 532, 635 против кролика или мыши. Отмытые в 1%-ном Triton X-100 на 0.01 М PBS (6 раз по 5 мин) срезы инкубировали во вторичных антителах (разведение 1 : 800 в смеси 1%-ный Triton X-100 + 0.03% NaNO3 на 0.01 M PBS), конъ-
югированных с флуорохромами, в течение 2 ч при 4°С. Отмытые в 0.1 М PBS (6 раз по 5 мин) срезы помещали в смесь глицерина с 0.1 М PBS (1 : 1) и исследовали с помощью флуоресцентных микроскопов Axioscope Carl Zeiss (Германия) и Axio-scope Opton (Германия), лазерного сканирующего конфокального микроскопа Leica TSC SPE (Германия). Полученные изображения обрабатывали с помощью программ LAS AF Lite 1.7.0., Amira 5.2.2., Adobe Photoshop CS2.
У контрольных препаратов, инкубированных в бычьей сыворотке без первичных антител, было обнаружено негативное окрашивание.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На сериях продольных и поперечных срезов D. dendriticum было исследовано распределение в тканях PG Е2, ГАМК, 5-НТ, FMRF-амида и а-ту-булина.
Выявление простагландина E. Интенсивная иммунореакция (ИР) на PG E2 была выявлена в крупных клетках, расположенных в зоне кортикальной паренхимы и субтегумента. Клетки имели овальную или неправильно вытянутую форму перикариона и давали отростки, пронизывающие тегумент. Специфическую реакцию на PG Е2 наблюдали как в цитонах, так и в отростках этих клеток, а также в каплевидных расширениях на поверхности наружной цитоплазмы тегумента (рис. 1а, в).
При двойном окрашивании срезов антителами к PG E2 и антителами к а-тубулину были выявлены участки наложения положительной ИР на оба вещества в тегументе, субтегументе и паренхиме (рис. 1б, г). PG Е2-позитивные участки клеток были расположены внутри а-тубулин-позитив-ных участков и занимали меньшую по сравнению с ними площадь. Структуры, ИР на а-тубулин, имели вид крупных клеток овальной, округлой или неправильной формы, залегающих в кортикальной паренхиме. Клетки посылали в субтегу-мент длинные тяжи, оканчивающиеся в наружной цитоплазме тегумента булавовидными расширениями. Внутри булавовидных расширений поверхностного слоя тегумента и в кортикальной паренхиме были выявлены наиболее интенсивно окрашенные PG Е2-позитивные участки клеток, расположенные внутри а-тубулин-позитивных участков. Менее интенсивную реакцию к PG Е2 наблюдали в субтегументальных а-тубулин-по-зитивных тяжах.
Выявление у-аминомасляной кислоты. С помощью окраски криосрезов антителами к ГАМК была обнаружена специфическая ИР в сколексе и теле плероцеркоида, в области центральной нерв-
Рис. 1. Области иммунореактивности по отношению к PG Е2 (а, в) и а-тубулину (б, г) в тегументе и паренхиме плеро-церкоида D. dendriticum. Поперечные срезы, двойное окрашивание. а — PG Е2-позитивные структуры в тегументе (головки стрелок) и кортикальной паренхиме (стрелки). б — а-тубулин-ИР там же, конфокальная пара с 1а. Показаны ИР к а-тубулину клетки (стрелки) с отростками, направленными в тегумент, а также каплевидные структуры на поверхности тегумента (головки стрелок). в — ядерные участки PG Е2-позитивных клеток в кортикальной паренхиме (стрелки); г — анти а-тубулин-ИР там же, конфокальная пара с 1в. Показаны ИР к а-тубулину отростки (стрелки). Конфокальный лазерный микроскоп; для рис. 1, 2, 4, 5. Масштаб: 10 мкм.
ной системы (ЦНС) и периферической нервной системы (ПНС) и на поверхности мышечных слоев (рис. 2).
В ЦНС ГАМК-ИР-элементы были выявлены в церебральном ганглии (ЦГ) и главных нервных стволах (ГНС), где они образовывали интенсивно окрашенные участки как в нейропиле, так и в отходящих отростках. В сколексе ГАМК-ИР-ней-роны находились вблизи ганглионарных нейро-пилей (рис. 2). ГАМК-ИР-отростки выходят из ГНС в двух направлениях: латерально (к субтегу-менту латерального края тела) и центрально (к поверхности поперечных мышечных волокон). Тела ГАМК-ИР-нейронов имели темную ядер-
ную зону с интенсивным окрашиванием перика-риона и отростков.
В ПНС на поверхности всех слоев мышц была выявлена интенсивная ГАМК-ИР, формирующая сеть тонких ИР-отростков на поверхности мышечных клеток. Продольные,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.