МИКРОБИОЛОГИЯ, 2010, том 79, № 4, с. 475-480
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.282.23.017
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ДРОЖЖЕЙ Уаггом>1а Иро1уйса ПРИ СИНТЕЗЕ ИЗ ЭТАНОЛА а-КЕТОГЛУТАРОВОЙ КИСЛОТЫ
© 2010 г. |А. П. Ильченко|, В. Я. Лысянская, Т. В. Финогенова1, И. Г. Моргунов
Учреждение Российской академии наук Институт биохимии и физиологии микроорганизмов
им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино Поступила в редакцию 01.10.2009 г.
Исследование содержания свободных аминокислот в клетках дрожжей Уагтта Нро1уйса, выращенных на этаноле в условиях дефицита тиамина, показало, что среди 17 обнаруженных свободных аминокислот в наибольшей концентрации присутствуют глутамат, аланин и у-аминомасляная кислота (у-АМК). Куль-туральная жидкость не содержала аминокислот. Анализ ферментов окислительного обмена при росте дрожжей в этих условиях показал, что бесклеточный гомогенат содержит значительные активности глу-таматдекарбоксилазы, у-АМК-трансаминазы и сукцинилсемиальдегид дегидрогеназы. Это указывает на то, что в клетках в условиях жесткого дефицита тиамина сукцинат образуется из глутамата в реакции, катализируемой 4-аминобутират-аминотрасферазой (у-аминобутиратный шунт). Проведенные исследования позволяют заключить, что выращивание дрожжей У. Нро1уйса на этаноле в условиях дефицита тиамина вызывает адаптивные стрессовые изменения метаболизма. Физиологические изменения выражаются в увеличении потребления аммонийного азота и экскреции а-кетоглутаровой кислоты, метаболические изменения — в функционировании у-аминобутиратного шунта, высокой активности малатдегидрогена-зы; в азотном обмене — в возрастании активностей реакций переаминирования.
Ключевые слова: дрожжи, свободные аминокислоты клетки, цикл Кребса, у-аминомасляная кислота, а-кетоглутаровая кислота, сукцинат, трансаминазы, сукциносемиальдегид.
В ранее опубликованной работе [1] на основании полученных результатов мы предположили, что образование сукцината в клетках дрожжей Yarrowia li-polytica при культивировании в условиях дефицита тиамина осуществляется через декарбоксилирова-ние глутамата с образованием у-аминомасляной кислоты.
4-аминомасляная кислота (4-АМК или у-АМК) широко представлена как в клетках прокариот, так и эукариот. Эта аминокислота, не входящая в белки, составляет значительную часть пула свободных аминокислот у эукариот, в том числе и у дрожжей [2—7]. Установлено, что у-АМК является продуктом метаболизма глутамата (рис. 1) при его декарбоксилиро-вании глутаматдекарбоксилазой (ГДК).
Баланс между синтезом и деградацией у-АМК регулируется соотношением активностей ферментов ГДК, у-АМК-трансаминазы и сукцинилсемиальдегид дегидрогеназы [8]. Конечным продуктом деградации у-АМК у млекопитающих является сукцинат. В то же время, у растений и микроорганизмов деградация у-АМК при определенных условиях может приводить к образованию 4-гидроксибутирата (у-гидроксибутирата), а не сукцината [9].
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: finog@ibpm.pushchi-no.ru).
Как известно, у-АМК и глицин являются основными тормозящими медиаторами головного и спинного мозга (в отличие от глутамата и аспартата, которые относятся к возбуждающим медиаторам). Нарушение биосинтеза и секреции у-АМК у человека приводит к различным заболеваниям, в том числе к эпилепсии и болезни Паркинсона [10, 11].
У растений и микроорганизмов функция у-АМК значительно менее изучена. Установлено, что они могут использовать эту аминокислоту в качестве источника углерода и азота [12, 13]. у-АМК быстро аккумулируется в клетках дрожжей в ответ на различные абиотические стрессы, такие как гипоксия, охлаждение, окислительный стресс [6]. Например, присутствие у-АМК образующего фермента — глутаматдекарбоксилазы, определяет высокую устойчивость клеток 8. сегеу181ае к окислительному стрессу [6].
Культивирование дрожжей в условиях дефицита азота, витаминов или микроэлементов, приводящее как к физиологическим, так и метаболическим изменениям также можно отнести к стрессовым ситуациям. Например, выращивание дрожжей У. Иро1уИ-са на этаноле при дефиците тиамина [1] вызывает сверхсинтез и экскрецию а-кетоглутаровой кислоты (КГК). В связи с этим, целью наших исследований являлось изучение адаптивных метаболических
а-Кетоглутарат
АГД
Глутамат
CO2
ГДК
у-Аминомасляная кислота КГК, ПВКЧ
у-АТ
Глутамат Аланин
Сукциносемиальдегид НАД
ССДГ
НАДШ
Сукцинат
Рис. 1. Схема синтеза сукцината из глутамата и у-амино-масляной кислоты. АГД-аминирующие глутаматдегид-рогеназы, ГДК-глутаматдекарбоксилаза, у-АМК АТ — у-АМК-аминотрансфераза (КФ 2.6.1.19), ССДГ-НАД-зависимая сукциносемиальдегид дегидрогеназа (КФ 1.2.2.16). КГК — а-кетоглутаровая кислота, ПВК — пировиноградная кислота.
изменении при культивировании данных дрожжей в условиях дефицита тиамина.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. В работе использовали му-тантный штамм дрожжей Уаггота Иро1уИса № 1, отобранный как активный продуцент а-кетоглутаровой кислоты (КГК) из этанола [14]. Штамм поддерживается на минерально-солевой среде с парафином в лаборатории аэробного метаболизма микроорганизмов ИБФМ РАН.
Условия культивирования. Дрожжи выращивали в ферментере АНКУМ-2М с рабочим объемом 1.5 л в
условиях, описанных в предшествующих исследованиях [15, 16]. В качестве источника углерода использовали этанол (1—2.5 г/л). Концентрация тиамина в условиях синтеза КГК — 3 мкг/л. В зависимости от целей эксперимента источник азота — (NH4)2SO4, по мере потребления добавляли однократно или постоянно, поддерживая концентрацию (NH+) на уровне 1.4—1.6 г/л.
Определение органических кислот и аминокислот.
Содержание органических кислот в среде культивирования определяли изократической ВЭЖХ на колонке Aminex HPX-87H, 300 х 7.8 мм ("Bio-Rad"), как описано ранее [17].
Для определения свободных аминокислот в клетках дрожжей биомассу лиофилизировали. Затем к 20—30 мг сухой биомассы добавляли 2 мл 80%-го подкисленного HCl этанола и выдерживали 24 ч при комнатной температуре. Полученный экстракт центрифугировали, осадок удаляли, а супернатант использовали для исследования на анализаторе аминокислот по методу Спекмана с соавторами [18]. Расчеты результатов анализа проводили по методу абсолютной калибровки.
Свободные аминокислоты в культуральной жидкости определяли после ее обработки 3%-ной три-хлоруксусной кислотой тем же методом [18].
Определение активности ферментов. Методы дезинтеграции клеток, получения бесклеточного гомо-гената, а также методы определения активности ферментов цикла Кребса, глиоксилатного шунта и переаминирования описаны в предшествующих работах [1, 19].
Определение активности глутаматдекарбоксила-зы (ГДК) (КФ 4.1.1.15) проводили в реакционной смеси объемом 3 мл, содержащей: 50 мМ КН2РО4 (рН 7.0), 20 мМ глутамат, 10 мкМ пиридоксаль-5-фосфат, 5мМ аминооксиацетат (ингибитор переа-минирования) и бесклеточный гомогенат. Инкубацию проводили при температуре 37°С, 60 мин при постоянном перемешивании. Реакцию останавливали добавлением 5% трихлоруксусной кислоты. Полученный после центрифугирования (10000 g, 10 мин) супернатант исследовали на аминокислотном анализаторе. Активность ГДК расчитывали по скорости образования у-АМК или по убыли глутамата [6].
При анализе активности 4-аминобутират:2-ок-соглутарат аминотрансферазы (КФ 2.6.1.19) реакционная смесь содержала: 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8.2), 0.2 мМ ЭДТА, 7.5 мМ КГК, 7.5 мМ 4-АМК и 0.2 мМ НАД и бесклеточный гомогенат. Конечный объем реакционной смеси — 3 мл. Образование НАДН фиксировали при 340 нм [4].
Анализ активности сукциносемиальдегид дегид-рогеназы (КФ 1.2.1.16) проводили в среде, содержащей 100 мМ калий-фосфатный буфер (рН 8.2), 0.2 мМ ЭДТА, 0.2 мМ НАД, 0.1 мМ сукцинилсеми-
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ДРОЖЖЕЙ Уаттш \ipolytica
477
15 г
10 -
5 -
(а)
15 г
(а)
50 ^
+ "
К
£
Я
- 25
и
24 48
72 96 Часы (б)
1
120 144
25
20
15
10
0 24 48 72 96 120 144 Часы
Рис. 2. Динамика роста (а) и содержание аминокислот в клетках (б) при культивировании дрожжей на этаноле. а: 1 — динамика роста, 2 — концентрация азота, 3 — накопление КГК в культуральной жидкости. В месте, указанном на рисунке стрелкой, проводили однократное добавление ^Н4)2Б04 до уровня 40— 45 мМ. б: 1 — глутамат, 2 — аланин, 3 — у-АМК.
% £
J 2
10
а с с а
о 8
Б
5 -
35 30 25 20 15 10
- 50
+
4
к
£
- 25
и
24 48 72 96 120 144 Часы (б)
1
■х2
О
0 24 48 72 96 120 144 Часы
Рис. 3. Динамика роста (а) и содержание аминокислот в клетках (б) при культивировании дрожжей на этаноле в условиях поддержания постоянной концентрации ^Н^Оф а: 1 — динамика роста, 2 — концентрация азота, 3 — накопление КГК в культуральной жидкости. В местах, указанных на рисунке стрелками, проводили добавление до уровня 40—45 мМ. б: 1 — глутамат, 2 — аланин, 3 — у-АМК.
0
0
0
5
5
альдегид (ССА) и бесклеточный гомогенат. Реакцию начинали добавлением ССА. Восстановление НАД измеряли при 340 нм [4]. Активность остальных ферментов таблицы определяли по методам, приводимым в работах [16, 19].
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Экскреция КГК и пул свободных аминокислот. На
рис. 2а приведена диамика роста культуры У. lipolyti-са на этаноле в условиях дефицита тиамина и рО2 = = 50% при однократным добавлении источника азота ^Н4)2804. Видно, что рост культуры сопровождается снижением концентрации источника азота ниже 20—25 мМ; в этих условиях синтез КГК довольно слабый. Дополнительное внесение источника азота (рис. 2а) приводило к усилению синтеза этого продукта, но и он постепенно
прекращался при снижении концентрации ниже критической величины (1—2 мМ).
Напротив, при поддержании концентрации источника азота на высоком уровне за счет его дробного, многократного внесения в среду экскре-
ция КГК резко возрастала (рис. 3а). Это свидетельствует о том, что определенный высокий уровень азота необходим для формирования адаптивных реакций, в первую очередь, сопряженных с синтезом КГК и поддержанием высокого уровня в клетке свободных аминокислот. В то же время свободных аминокислот в культуральной среде не было.
Качественный анализ свободных аминокислот в клетках показ
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.