РАДИАЦИОННАЯ БИОЛОГИЯ. РАДИОЭКОЛОГИЯ, 2011, том 51, № 2, с. 252-257
-- УФ-ОБЛУЧЕНИЕ
УДК [57+61]::539.1.04:614.875:591.144
ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА УФ-ОБЛУЧЕННЫХ ЛИМФОЦИТОВ © 2011 г. В. Г. Артюхов1*, О. В. Земченкова2, О. В. Башарина1, Я. В. Ким1
1 Воронежский государственный университет 2 Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко
Исследовано влияние УФ-света (240—390 нм) в дозах 151 и 755 Дж/м2 на функциональные свойства ключевых ферментов метаболизма лимфоцитов крови доноров: лактатдегидрогеназы (ЛДГ), цито-хром с оксидазы (ЦО), сукцинатдегидрогеназы (СДГ), Са2+-АТФазы плазматических мембран. Установлено, что фотоинактивация ферментов непосредственно после облучения, приводящая к снижению количества АТФ в лимфоцитах, сменяется повышением активности исследуемых ферментов в ходе суточной инкубации лимфоцитов. В результате уровень АТФ в фотомодифицирован-ных лимфоцитах не отличается от такового в нативных клетках до инкубации. Это указывает на нормализацию биохимических процессов в лимфоцитах, облученных дозами УФ-света, используемыми при АУФОК-терапии.
Лимфоциты, УФ-свет, лактатдегидрогеназа, цитохром с оксидаза, сукцинатдегидрогеназа, Са2+-АТФаза, пе-роксидное окисление липидов.
При лечении ряда заболеваний воспалительного генеза широко используется метод ауто-трансфузии УФ-облученной крови (АУФОК). АУФОК приводит к улучшению иммунологического статуса организма, что может быть следствием структурно-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток, индуцируемых при действии на них УФ-света в дозах, применяемых в фототерапии [1, 2]. Однако до настоящего времени остаются малоизученными многие аспекты физико-химических механизмов лечебного эффекта фотомодифицированной крови. Предполагается, что передача вызванных светом изменений от фотомодифицированных клеток к интактным является следствием образования облученными лейкоцитами активных форм кислорода (АФК) и немедленной инициации каскада АФК-образующих реакций в объеме всей циркулирующей крови [3, 4]. Известно, что ключевым моментом в фотомодификации клеток УФ-излу-чением является индукция пероксидного фотоокисления липидов (ПФОЛ). Это приводит к изменению структуры мембран и нарушению их целостности [5, 6]. В результате как ПФОЛ, так и непосредственного действия АФК на системы транспорта ионов повышается проницаемость мембран для различных веществ, в том числе — для ионов кальция, которые являются важнейшими вторичными мессенджерами и в то же время принимают участие в образовании АФК,
* Адресат для корреспонденции: 394006 Воронеж, Университетская пл., 1, ГОУ ВПО ВГУ; тел.: (4732) 20-89-81, (4732) 20-85-86; факс: (4732) 20-83-08; e-mail: avg@ main.vsu.ru.
влияя на активность ферментов ряда АФК-обра-зующих и антиоксидантных систем [7].
Естественно, что изменения функционирования иммуноцитов не могут не иметь метаболической основы. Применение УФ-света как модулятора функциональной активности лимфоцитов ведет к изменению метаболизма клеток, переключая субстратные потоки с одного метаболического пути на другой, влияя на энергетические и синтетические процессы в них.
Сообщения о токсическом действии АФК (повышение уровня ПОЛ, инактивация ферментов) вызывают неоднозначное отношение к методу АУФОК [8, 9]. В связи с вышеизложенным возникает необходимость проведения исследований, направленных на изучение молекулярно-клеточ-ных механизмов, лежащих в основе изменений метаболизма лимфоцитов. В данной статье рассматривается действие УФ-света на функциональные свойства ключевых ферментов дихотомического пути окисления глюкозы как анаэробного — лактатдегидрогеназы (ЛДГ), так и аэробного — цитохром с оксидазы (ЦО) и сукцинатдегидрогеназы (СДГ), ответственных за энергообеспечение лимфоцитов крови человека.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДИКА
Выделение лимфоцитов из периферической крови доноров осуществляли путем ее центрифугирования в градиенте плотности фиколл-урогра-фина (р = 1.077 г/см3).
l-2
S, мВ с
8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 0
Доза облучения, Дж/м2
Рис. 1. Влияние УФ-света на люминолзависимую хе-милюминесценцию лимфоцитов: 1 — интенсивность хемилюминесценции; 2 — светосумма хемилюминес-ценции.
УФ-облучение исследуемых образцов (2 х 106 клеток/мл) проводили при их непрерывном перемешивании магнитной мешалкой в термостатируе-мой кювете (20 ± 1°С) с помощью ртутно-кварце-вой лампы типа ДРТ-400 через светофильтр УФС-1 с полосой пропускания 240—390 нм в течение 1 и 5 мин. Интенсивность облучения составляла 151 Дж/(м2 мин). Объем вносимого в кювету образца составил 2 мл.
Лимфоциты инкубировали в питательной среде RPMI-1640 при температуре 37°С в атмосфере с [СО2] = 5%.
Концентрацию АТФ определяли с помощью люциферазной биолюминесцентной реакции с использованием стандартного набора реагентов ("Люмтек", Россия). Регистрацию интенсивности люминесценции проводили на спектрофлюо-риметре $Ышаё2и RF-1501 (Япония).
Для определения активности ферментов клетки лизировали путем гипоосмотического шока и с помощью дифференциального центрифугирования разделяли митохондрии и плазматические мембраны [10]. В митохондриях определяли активность митохондриальных ферментов — СДГ и ЦО [11], над осад очную жидкость (клеточный экстракт) использовали для определения активности цитоплазматического фермента — ЛДГ [12]. Активность Са2+-АТФазы плазматических мембран определяли по методу [13]. Все измерения проводили на спектрофотометре $Ытаё2и RF-5301 РС (Япония).
Об интенсивности процессов пероксидного окисления липидов (ПФОЛ) судили по уровню спонтанной (нестимулированной) люминол-за-висимой хемилюминесценции [14]. Регистрацию проводили в течение 500 с на биохемилюмино-
A, мкмоль/л 8
_-2
к
I
0 151
Доза облучения, Дж/м
755
2
Рис. 2. Влияние УФ-света на активность ряда ферментов лимфоцитов непосредственно после их облучения: 1 - ЛДГ (х10-2); 2 - СДГ; 3 - ЦО; 4 - Са2+-АТФаза.
метре БХЛ-06М, оценивали максимальную интенсивность и светосумму хемилюминесценции.
Статистическую обработку результатов исследований проводили с помощью пакета программ "Excel". Отличия величин тестируемых показателей в контрольных и опытных сериях экспериментов оценивали с помощью метода попарной статистики, используя i-критерий Стьюдента, с уровнем значимости 5%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Выявлено, что непосредственно после УФ-об-лучения суспензии лимфоцитов в дозах 151 и 755 Дж/м2 в клетках происходит дозозависимое увеличение уровня спонтанной люминолзависи-мой хемилюминесценции (рис. 1) и снижение активности ЛДГ, СДГ и ЦО (рис. 2). Снижение активности цитоплазматического фермента — ЛДГ — обусловлено конформационными перестройками молекулы, подробно рассмотренными в [15]. Выявленное нами снижение активности митохондриальных ферментов (СДГ и ЦО) непосредственно после облучения клеток может быть связано с рядом причин. Молекула ЦО, содержащая низкоспиновый гем а и высокоспиновый гем а3, а также расположенные вблизи них ароматические аминокислотные остатки, поглощает энергию УФ-света порфириновыми кольцами и ароматическими аминокислотами. Это может приводить к нарушению структуры активного центра фермента, что незамедлительно сказывается на его ферментативной активности. СДГ, яв-
1
4
254
АРТЮХОВ и др.
[АТФ], пкмоль/л
Время, ч
Рис. 3. Изменение концентрации АТФ в ходе 24-часовой инкубации лимфоцитов: 1 — нативные лимфоциты; 2, 3 — фотомодифицированные в дозе 151 и 755 Дж/м2 лимфоциты.
ляясь по своей структуре железосерофлавопроте-ином, содержит в составе активного центра сульфгидрильные группы. Возможно, именно окисление SН-групп является причиной фотоинактивации фермента.
Кроме того, УФ-облучение оказывает не только прямое действие на структуру ферментов. Известно, что важной особенностью эффектов УФ-света на молекулярно-клеточном уровне является их зависимость от присутствия кислорода [16]. Основными потребителями кислорода в клетках являются митохондрии. При поглощении квантов света специальными ферментными системами осуществляется восстановление молекул кислорода с образованием активных форм кислорода (АФК). Наибольший вклад в генерацию АФК вносит дыхательная цепь митохондрий. УФ-облучение приводит к увеличению продукции свободных радикалов, что, в свою очередь, стимулирует процессы ПФОЛ. Так как внутренняя мембрана митохондрий содержит большое количество белков, в частности СДГ и ЦО, то они являются одними из первичных мишеней АФК в клетках. Стимулирование ПОЛ усугубляет негативные эффекты, вызванные действием облучения (фотохимическая аллотопия) [17].
Таким образом, УФ-свет вызывает фотоинактивацию ферментов, что ведет к снижению уровня как аэробного, так и анаэробного путей окисления глюкозы, а следовательно, снижается энергообеспечение клеток, что согласуется с фактом уменьшения концентрации АТФ через 4 ч после УФ-облучения лимфоцитов (рис. 3).
А, отн. ед.
Время, ч
Рис. 4. Изменение активности Са2+-АТФазы в ходе 24-часовой инкубации лимфоцитов: 1 — нативные лимфоциты; 2, 3 — фотомодифицированные в дозах 151 и 755 Дж/м2 лимфоциты.
Активность Са2+-АТФазы плазматических мембран увеличивается на 13% после облучения клеток в дозе 755 Дж/м2. Использование меньшей дозы облучения не приводит к статистически достоверному изменению активности фермента. Повышение активности Са2+-АТФазы на начальных стадиях ПФОЛ происходит за счет накопления гидроперекисей фосфолипидов [18]. Наблюдаемое через 4 ч снижение активности фермента с последующим повышением данного параметра (рис. 4), по всей видимости, связано с обратимым ингибированием Са2+-АТФазы, в основе которого лежит обеднение микроокружения фермента полиеновыми фосфолипидами. Известно, что Са2+-АТФаза инактивируется при повышении уровня ПОЛ в мембране. С другой стороны, активность Са2+-АТФазы плазматических мембран регулируется кальмодулином — при повышении концентрации ионов кальция в клетке фермент активируется [18]. Наблюдаемая активация кальциевого насоса может быть вызвана повышением концентрации Са2+ в цитоплазме — как за счет его выхода из внутриклеточных депо (митохондрии и эндоплазматическая сеть), так и в резул
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.