ОНТОГЕНЕЗ, 2011, том 42, № 6, с. 453-464
= ЭМБРИОГЕНЕЗ И КАНЦЕРОГЕНЕЗ
УДК 576.385.5
ОСОБЕННОСТИ МОРФОЛОГИИ, МЕЖКЛЕТОЧНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ И МИГРАЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ ЭПИТЕЛИОЦИТОВ IAR-2, ТРАНСФОРМИРОВАННЫХ ОНКОГЕНОМ RAS: ВКЛАД БЕЛКА МЕЖКЛЕТОЧНОЙ АДГЕЗИИ Е-КАДХЕРИНА
© 2011 г. И. Ю. Житняк, Н. А. Глушанкова
НИИ канцерогенеза, Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН,
115478Москва Каширское ш., д. 24 E-mail: natglu@hotmail.com Поступила в редакцию 09.09.2010 г.
Окончательный вариант получен 16.12.2010 г.
Разрушение стабильной межклеточной адгезии и приобретение способности к миграции являются закономерными этапами неопластической эволюции опухолевых клеток эпителиального происхождения. В работе были исследованы морфологические и миграционные характеристики эпителиоци-тов клонов IAR1162 и IAR1170, полученных из смешанной культуры трансформированных онкогеном N-RasV12 клеток линии IAR-2. Было обнаружено, что мутантный онкоген RAS может вызвать два типа морфологических изменений эпителиоцитов IAR-2. Клетки одного типа (клоны IAR1162) прошли эпителиально-мезенхимальный переход: утратили экспрессию Е-кадхерина, приобрели фибробластоподобную морфологию, не образовывали плотные контакты. Клетки другого типа (клоны IAR1170) сохранили морфологию, близкую к морфологии нетрансформированных предшественников, образовывали межклеточные Е-кадхерин-содержащие адгезионные контакты и плотные контакты, формировали монослой в конфлуэнтной культуре. Вместе с тем, как в клетках 1AR1162, так и в клетках IAR1170 мутантный онкоген RAS вызывал разрушение краевого актиново-го пучка и реорганизацию межклеточных адгезионных контактов. Трансформированные эпителио-циты IAR1162 и IAR1170 приобрели способность мигрировать по плоскому субстрату, а также через узкие поры в мембранах миграционных камер. Видеомикроскопические исследования культур трансформированных эпителиоцитов продемонстрировали нестабильность межклеточных контактов и независимый характер миграции клеток. Эпителиоциты IAR1170, имеющие Е-кадхерин-содержащие АК, были также способны перемещаться в составе группы (коллективная миграция). Клетки 1162D3, утратившие в результате Ras-трансформации экспрессию эндогенного Е-кадхерина, были трансфицирова-ны плазмидой, несущей ген CDH1, и в результате трансфекции были получены клоны клеток с различным уровнем экспрессии экзогенного Е-кадхерина. Высокий уровень экспрессии экзогенного Е-кадхерина в трансформированных эпителиоцитах приводил к снижению скорости миграции на двумерном субстрате клеток, находящихся в контакте с соседними клетками, практически не влияя на миграцию одиночных клеток, но, вместе с тем, увеличивал количество клеток, мигрировавших через поры в миграционных камерах. Таким образом, разрушение краевого актинового пучка и изменение пространственной организации межклеточных адгезионных контактов, несмотря на наличие или отсутствие в них Е-кадхерина, сопровождается разрушением стабильной межклеточной адгезии и появлением локомоторной активности у Ras-трансформированных эпителиоцитов. Сохранение Е-кадхерина в межклеточных адгезионных контактах влияет на локомоторную активность трансформированных эпителиоцитов и играет важную роль в их коллективной миграции.
Ключевые слова: трансформированные эпителиоциты, актиновый цитоскелет, межклеточные контакты, Е-кадхерин, миграция.
Инвазия и метастазирование клеток из первичной опухоли являются ключевыми моментами опухолевой прогрессии. Нарушения межклеточной адгезии при трансформации играют существенную роль в развитии инвазивного потенциала опухолевых клеток. В настоящее время общепринятой точкой зрения является представление о том, что программа эпителиально-мезенхи-
мального перехода (ЭМП), при котором дифференцированные эпителиальные клетки превращаются в фибробластоподобные клетки, способные к миграции, является основным механизмом эволюции клеток карцином (ТЫегу, 2002; АсЫапё е! а1., 2003). В ходе ЭМП происходит разрушение стабильной межклеточной адгезии, главным образом, за счет угнетения экспрессии
или аккумуляции на мембране Е-кадхерина, при этом эпителиальные клетки начинают экспрес-сировать мезенхимальные маркеры (N-кадхерин, фибронектин, виментин) (Rosivatz et al., 2002; Yang et al., 2004; Wheelock et al., 2007; Thiery et al., 2009).
Угнетение экспрессии Е-кадхерина и связанное с этим разрушение межклеточной адгезии часто рассматривается как пусковой механизм инвазии и диссеминации опухолевых клеток (Perl et al., 1998; Brabietz et al., 2001; Prall, 2007). Вместе с тем хорошо известно, что ряд карцином человека, в частности протоковые карциномы молочной железы, карциномы толстой кишки, мелано-мы могут сохранять экспрессию Е-кадхерина (Nabeshima et al., 1999; Gillett et al., 2001; Heger-feldt et al., 2002). Показано также, что опухолевые клетки способны к миграции и инвазии и в отсутствие ЭМП, что свидетельствует о возможности существования механизмов запуска инвазии, не связанных с угнетением экспрессии и аккумуляции на мембране Е-кадхерина (Tarin et al., 2005; Wicki et al., 2006; Wolf et al., 2007).
Ранее мы обнаружили, что неопластическая трансформация эпителиальных клеток может приводить к исчезновению типичного для эпите-лиоцитов краевого актинового пучка и реорганизации межклеточных Е-кадхерин-содержащих адгезионных контактов (АК), разрушающих стабильную межклеточную адгезию (Ayollo et al., 2009). Вместе с тем, до сих пор оставалось неясным, как влияет сохранение в клетках экспрессии главной молекулы межклеточной адгезии Е-кадхерина на морфологические и миграционные характеристики трансформированных эпи-телиоцитов.
Целью данной работы было сравнительное исследование морфологии, межклеточных взаимодействий и миграционной активности Ras-транс-формированных эпителиоцитов IAR1162, утративших экспрессию Е-кадхерина, и Ras-транс-формированных эпителиоцитов IAR1170, сохранивших экспрессию Е-кадхерина.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Клеточные культуры. В работе была использована постоянная линия нетрансформированных эпителиоцитов IAR-2, полученная из эксплантата печени крысы (Montesano et al., 1975). Линии эпителиальных клеток, трансформированные онкогеном N-R^S, были получены путем инфекции кДНК мутантного гена человека N-RasV12 в составе вириона ретровируса (pPS/hygro) в клетки исходной линии IAR-2, с отбором трансформантов в среде с гигромицином (200 мкг/мл) (Gloush-ankova et al., 1994) с последующим клонированием. Были получены клоны Ras-трансформирован-
ных эпителиоцитов IAR1170: 1170D6, 1170D11, 1170F9, 1170Н5, 1170D12, имевших морфологию, близкую к морфологии нетрансформированных эпителиоцитов, а также клоны Ras-трансформи-рованных эпителиоцитов IAR1162: 1162D3, 1162F4, клетки которых имели вытянутую, фибробластопо-добную морфологию. Клетки клона 1162D3 были трасфицированы плазмидой BIEcwt, несущей кДНК гена CDH1 (Е-кадхерин). В результате клонирования были получены клоны 1162D3-EI7, 1162D3-EK2, 1162D3-EP8, 1162D3-EM5, 1162D3-EJ7, различающиеся по уровню экспрессии экзогенного Е-кадхерина.
Культивирование клеток. Клетки культивировали в среде DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) (Sigma, США) с добавлением 7.5% эмбриональной телячьей сыворотки (РРА Lab., Австрия) и антибиотиков (пенициллин, стрептомицин, 100 ед/мл) при температуре 37°С во влажной атмосфере в присутствии 5% CO2. Линии, трас-фицированные плазмидой BIEcwt, культивировали в среде с добавлением G-418 (1 мг/мл) (Sigma, США).
Клонирование клеток. Клетки снимали с подложки 0.1% трипсином на растворе Версена. Исходя из концентрации клеток в суспензии, производили серию разведений до концентрации клеток 10 кл/мл и раскапывали по 100 мкл в лунки 96-луночной плашки. Выросшие колонии пересаживали в 12-луночные плашки, после чего подросшие клоны окрашивали на Е-кадхерин и отбирали с помощью иммунофлуоресцентной микроскопии.
Трансфекция клеток. Трансфекция плазмидой BIEcwt производилась на 20-часовой редкой культуре клеток в чашках Петри с помощью Lipo-fectamine™ LTX и Plus™ Reagent (Invitrogen, США). Через 2 суток в среду на 2 недели добавляли селектирующий агент G-418. Для выявления эффективных трансфектантов было использовано иммунофлуоресцентное окрашивание Е-кад-херина. В результате клонирования смешанной культуры были получены клоны, в клетках которых в присутствии G-418 стабильно экспрессиро-вался экзогенный Е-кадхерин.
Фиксация клеток. Для флуоресцентного окрашивания актиновых филаментов клетки фиксировали 3.7% раствором параформальдегида на PBS (фосфатный буфер, рН 7.2) в течение 10 мин, отмывали и обрабатывали 0.5% раствором Triton Х-100 (Sigma, США) на PBS в течение 3 мин. Для иммунофлуоресцентного окрашивания белков межклеточных контактов (Е-, N-кадхерина, ок-клюдина) применяли фиксацию метанол-ацетоном (1 : 1) в течение 10 мин при —20°С.
Иммунофлуоресцентное окрашивание и микроскопия. В качестве первичных антител в работе использовали моноклональные мышиные анти-
тела к Е-кадхерину, N-кадхерину (BD, Transduc-tion Laboratories, США), окклюдину (Invitrogen, Zymed, США). В качестве вторичных антител использовали моноклональные антитела к IgG мыши, меченные родамином (Jackson ImmunoRe-search, США), или меченные AlexaGreen488 (Invit-rogen, Molecular Probes, США). Для окраски актина использовался фаллоидин, меченный родамином (Sigma, США), или А1ехаGreen488-фал-лоидин (Invitrogen, Molecular Probes, США). Фиксированные клетки на покровных стеклах помещали в раствор первичных антител на PBS и инкубировали в течение 40 мин, после чего отмывали PBS и окрашивали вторичными антителами. Препараты заключали в раствор поливинилового спирта (Sigma, США) на PBS и исследовали с помощью флуоресцентных микроскопов Axioplan (Zeiss, Германия) или Nikon Eclipse Ti (Nikon, Япония). Фотосъемку препаратов осуществляли с помощью цифровых камер Olympus DP70 с программным обеспечением DP Controller (Olympus, Япония) и Hamamatsu с программным обеспечением NIS-Elements AR (Nikon, Япония).
Морфометрия. Полученные изображения одиночных клеток использовали для морфометриче-ского анализа. Контуры клеток был
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.