ПРИКЛАДНАЯ БИОХИМИЯ И МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 44, № 3, с. 343-346
УДК 592;574.5;591.05
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА В КАЧЕСТВЕ СТРЕСС-МАРКЕРОВ У ВОДНЫХ ОРГАНИЗМОВ НА ПРИМЕРЕ БАЙКАЛЬСКИХ ЭНДЕМИЧНЫХ АМФИПОД
© 2008 г. М. А. Тимофеев*, Ж. М. Шатилина*, Д. С. Бедулина*, М. В. Протопопова*,
А. В. Колесниченко**
*Иркутский государственный университет, Иркутск, 664003 e-mail: mtim@irk.ru **Сибирский институт физиологии и биохимии растений СО РАН,
Иркутск, 664033 Поступила в редакцию 06.04.2006 г.
При использовании белков теплового шока (БТШ) в качестве биомаркеров при мониторинговых исследованиях водных экосистем необходимо учитывать возможную специфику синтеза данных белков у тех или иных организмов. Особенно это касается эндемиков и видов, узкоадаптированных к специфике условий обитания водоема. Проведена оценка применения БТШ в качестве молекулярных стресс-маркеров у узкоспециализированных видов на примере байкальских эндемичных амфипод (Crustacea, Amphipoda). Оценено влияние токсического и температурного стрессовых воздействий. В качестве биомаркеров были выбраны белки семейства БТШ70 и нмБТШ, родственные а-кристаллинам. Температурный и токсический стрессы вызывали синтез нмБТШ у исследованных эндемичных видов амфипод. В то же время индукция синтеза БТШ70 у тех же видов после температурного стресса не отмечена. Обсуждается специфика синтеза БТШ70. На основе полученных результатов предлагается использовать нмБТШ в качестве стресс-маркеров у байкальских и узкоспециализированных видов.
Синтез белков теплового шока (БТШ) представляет собой один из наиболее универсальных и распространенных механизмов защиты клетки от стрессовых повреждений [1-4]. Синтез БТШ индуцируется воздействиями различной природы - тяжелыми металлами [5-7], органическими загрязнителями [8], изменением температуры окружающей среды [9-11], изменением давления [12], недостатком кислорода [13, 14], ультрафиолетовым излучением [15] и др. Индукцию синтеза БТШ и увеличение их количества используют в качестве маркеров стрессовых воздействий при мониторинговых исследованиях водных экосистем [9, 16-18]. Наиболее часто для этих целей применяют белки семейства БТШ70 [19-22].
При использовании БТШ в качестве биомаркеров при мониторинговых исследованиях водных экосистем необходимо учитывать возможную специфику синтеза данных белков у тех или иных организмов [23]. Особенно это касается специализированных и эндемичных форм. Эндемичные виды часто узко адаптированы к условиям обитания того или иного водоема. Таким образом, их характеристики, в силу особенностей эволюционного развития, могут иметь отличия от таковых у модельных организмов.
В литературе регулярно появляются сообщения о том, что у отдельных видов редуцированы или не детектируются реакции при использовании
широко применяемых белков семейства БТШ70. Так, при исследовании стрессового ответа у 6 видов пресноводных гидр рода Hydra было установлено, что у видов, обитающих при изменяющихся условиях среды, синтезируются БТШ нескольких групп, в том числе и множественные изоформы БТШ70, в то время как у вида Hydra oligactis, обитающего в условиях низких температур и постоянного уровня рН, синтез БТШ при воздействии стрессовых факторов не индуцируется [24, 25]. Сходные результаты получены при исследовании морских моллюсков [26]. У вида Collisella scabra, обитающего в стрессовой литоральной зоне, обнаруживается индукция синтеза БТШ, но у C. pelta, обитающего в более стабильных условиях, такой индукции не наблюдается. У моллюсков рода Tegula также наблюдаются отличия в синтезе БТШ70 в зависимости от условий обитания того или иного вида [2729]. У арктической рыбы Trematomus bernacchii, обитающей длительное эволюционное время в низкотемпературных условиях, не обнаруживается экспрессии БТШ70 при температурном воздействии [30, 31]. Были также исследованы виды рыб рода Poeciliopsis, обитающие в пустынях. Показано, что они различаются по количеству изоформ БТШ70 и ряда других групп БТШ в зависимости от условий их обитания [32, 33].
Таким образом, при выборе тест-объектов для мониторинга необходимы предварительные иссле-
дования с целью установления возможных отклонений исследуемых параметров от общепринятых. Особенно это относится к узкоспециализированным и эндемичным видам.
Одним из наиболее известных районов, характеризующихся высокой степенью эндемизма, является оз. Байкал. По имеющимся данным, в озере представлено более 2500 видов и подвидов животных, из них более чем 80% эндемичные формы [34]. Фауна Байкала идеально подходит для изучения как многообразия адаптивных реакций у специализированных видов, так и возможности применения тех или иных стресс-маркеров для их оценки.
Однако, несмотря на очевидную необходимость проведения подобных исследований на оз. Байкал, известны лишь единичные работы в данном направлении. Опубликованы результаты исследования характера синтеза БТШ70 при воздействии стрессовых факторов у эндемичных байкальских губок Ba-icalospongia intermedia, Lubomirskia fusifera, L. abietina [35]. При температурном стрессе у данных видов губок была отмечена зависимая от времени экспозиции экспрессия БТШ70. Воздействие модельных токсикантов, а также экспозиция организмов в сточных водах Байкальского целлюлозно-бумажного комбината привели к повышенному синтезу БТШ70. В другой работе [36] проведен поиск белков, иммунохимически родственных термостабильным белкам озимой пшеницы и БХШ310 озимой ржи у 6 эндемичных байкальских видов бычков. Из результатов вестерн-блоттинга видно, что у байкальских бычков присутствует ряд нативных цитоплазматических белков, иммунохимически родственных температурно-стабильным растительным белкам. Поиск полипептидов с им-мунохимическим сродством к растительному разобщающему белку БХШ310 у байкальских рыб показал, что таким сродством обладает белок с молекулярной массой 14 кДа. В то же время возможность прикладного использования полученных результатов авторами не обсуждалась.
Цель работы - оценка возможности и особенностей применения различных БТШ в качестве молекулярных стресс-маркеров у узкоспециализированных видов на примере байкальских эндемичных форм.
МЕТОДИКА
Объектом исследования были выбраны амфиподы (Crustacea, Amphipoda). Представители этого отряда ракообразных широко распространены в различных водоемах мира. Представитель отряда амфипод космополит Gammarus lacustris Sars часто используется для биотестирования, мониторинговых и экотоксикологических работ. Особенное разнообразие амфиподы получили в оз. Байкал, где представлено более 250 эндемичных видов, населяющих все типы грунтов и все глубины озера [34]. В экспериментах использовали следующие эндемич-
ные виды амфипод оз. Байкал: Eulimnogammarus cyaneus (Dyb.) и E. verrucosus (Gerstf.). Рачков отлавливали в зоне литорали в районе пос. Большие Коты (Южный Байкал). Перед экспериментами амфипод выдерживали 2-3 сут в аэрируемых аквариумах с байкальской водой при 6-8°С (предварительное содержание).
В работе проводили оценку влияния температурного фактора: амфипод выдерживали при 18°С в течение 24 ч и при 20°С - 3 сут, токсического фактора: экспозиция в течение 24 ч в растворах хлористого кадмия 3 концентраций: 5, 0.5 и 0.05 мг/л. Далее рачков замораживали в жидком азоте. Образцы для биохимического анализа отбирали из недифферен-цируемых тканей. Характер синтеза стрессовых белков определяли с использованием стандартного метода денатурирующего электрофореза с ДДС-Na в 12.5%-ном ПААГ. После чего проводили вестерн-блоттинг [37] с антителами к исследуемым белкам. В качестве биомаркеров стрессовых воздействиях были выбраны белки семейства БТШ70 и нмБТШ, родственные а-кристаллинам.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Основными функциями белков семейства БТШ70 является шапероновая активность: связывание белков, регулирование их сворачивания, транспорта и восстановления [38, 39]. Известен обширный ряд работ, подтверждающих участие белков семейства БТШ70 в механизмах адаптации водных организмов к неблагоприятным условиям, при этом отмечается индукция синтеза данного белка и его накопление в клетках [9, 20, 40, 41]. Родственные а-кристаллинам нмБТШ также выполняют функции молекулярных шаперонов: предотвращают агрегацию белков, помогают правильной укладке денатурированного белка [17, 18].
Температурный стресс вызывал синтез нмБТШ, иммунохимически родственных а-кристаллину, у исследованных эндемичных байкальских видов амфипод (рис. 1). Индукции синтеза БТШ70 у исследуемых видов (рис. 1) после температурного стресса отмечено не было. Токсический стресс индуцировал синтез нмБТШ с молекулярными массами 15, 28 и 57 кДа. Синтез белка с молекулярной массой 32 кДа зарегистрирован у всех исследованных видов. Показано, что интенсивность синтеза данного белка зависит от концентрации растворов токсиканта. Наибольший уровень данного белка обнаруживается у особей, экспонированных в растворе с самой высокой концентрацией CdCl2 -5 мг/л, а наименьший - в растворе с наименьшей концентрацией - 0.05 мг/л (рис. 2).
Как демонстрируют результаты, у исследованных байкальских амфипод индукции синтеза и увеличения количества БТШ70 при температурном воздействии не найдено. Таким образом, можно отметить специфику участия БТШ70 в системе стрессовой защиты эндемичных амфипод оз. Бай-
ОСОБЕННОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ БЕЛКОВ ТЕПЛОВОГО ШОКА
345
(а) (б)
1 2 3 12 3
(а) (б)
1 2 3 4 1 2 3 4
- 32 кДа
-— 32 кДа
Рис. 1. Вестерн-блоттинг на нмБТШ, родственных а-кристаллинам, у амфипод, экспонированных при 20°С у Eulimnogammarus cyaneus (а) и E. verrucosus (б); 1 - контроль, 2 - 30 мин, 3 - 3 сут.
кал. Ранее уже были описаны подобные случаи для некоторых видов гидробионтов [24, 30]. Вероятно, БТШ70, являясь типичным элементом стрессовых систем большинства организмов, у байкальских видов не играет основной роли в стрессовой адаптации. Можно предположить, что в системе активации синтеза БТШ70 у исследованных байкальских организмов могут быть зависимые от температуры элементы, работа которых нарушается при повышенных температурах. Так, например, ране
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.