ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 5, с. 730-737
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
ОСОБЕННОСТИ ПРОЯВЛЕНИЯ И НАСЛЕДОВАНИЯ TPD1 -ФЕНОТИПА У ИНСЕРЦИОННОГО МУТАНТА ТАБАКА С ДЛИТЕЛЬНЫМ
ПЕРИОДОМ ЦВЕТЕНИЯ
© 2007 г. Т. В. Баврина, Э. Л. Миляева, И. А. Гетман, Г. А. Романов
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 19.10.2006 г.
Проведено детальное исследование долгоцветущего инсерционного мутанта табака tpdl (от tobacco pollen development 1) Nicotiana tabacum L. сорта Самсун в ходе онтогенеза и установлен характер наследования мутантного фенотипа. Мутантные и исходные растения достоверно не различались по ряду основных характеристик их роста и морфогенеза вплоть до начала цветения. Различия проявлялись только в развитии мужской половой сферы, а именно в процессе роста пыльников и развития пыльцы. Пыльца tpdl -растений была недоразвитой и стерильной, что в итоге приводило к характерному бессемянному долгоцветущему фенотипу. Опыты с опылением мутантных цветков пыльцой нетрансгенных растений показали, что tpdl -фенотип может быть передан через семенное потомство, по крайней мере, в череде двух поколений, т.е. этот признак наследуем. Фенотип tpdl был прочно сцеплен с признаком устойчивости к канамицину, что указывает на непосредственную роль вставки векторной ДНК в проявлении наблюдаемой аномалии. Согласно полученным данным, tpdl представляет собой редкую доминантную моногенную мутацию с узконаправленным физиологическим действием. Предложена модель действия TPDl. Мутантный клон табака может представить интерес с точки зрения идентификации и клонирования нового гена TPDl, необходимого для формирования полноценной пыльцы.
Nicotiana tabacum - инсерционный мутант - цветение - мужская стерильность - ген TPDl
ВВЕДЕНИЕ
Важнейшая задача современной биологии вообще и физиологии растений в частности - это выяснение роли индивидуальных генов в онтогенезе и жизнедеятельности целостного организма. При исследовании функции растительных генов одним из основных подходов является трансгеноз с применением векторов на основе Т-ДНК агро-бактерий [1, 2]. Благодаря этому подходу стало возможным целенаправленно менять важнейшие характеристики растений, такие как рост, продуктивность, сроки и продолжительность цветения, устойчивость к различным неблагоприятным факторам и др. [1, 3, 4].
Функциональная роль индивидуального гена в организме особенно четко проявляется как при его сверхэкспрессии, так и при подавлении экс-
Сокращения: ПЦР - полимеразная цепная реакция; 35S CaMV - промотор гена 35S вируса мозаики цветной капусты; nptII - неомицинфосфотрансфераза; TPDl - ген развития пыльцы табака 1 (от tobacco pollen development 1). Адрес для корреспонденции: Романов Георгий Александрович. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Электронная почта: gar@ippras.ru
прессии. Одним из широко используемых способов "выключения" гена является инсерционный мутагенез. Хорошо известны банки инсерцион-ных мутантов арабидопсиса, которые активно применяются для анализа функций генов данного растения [5]. Однако инсерционные мутанты возникают не только у арабидопсиса, но нередко и у других растений при проведении их серийной трансформации с участием агробактерий. Эти редкие события могут проявляться как изменения фенотипа, никак не связанные с предполагаемой функцией встраиваемого целевого гена. Такие инсерционные мутанты могут помочь выявить неизвестные ранее гены, играющие ту или иную важную роль в ходе роста и развития растения.
Ранее при проведении серийной агробактери-альной трансформации растений табака среди десятков трансформантов было обнаружено одно растение с необычным фенотипом - резко увеличенной продолжительностью цветения [6]. Таким образом, данное растение проявило типичные признаки инсерционного мутанта. Как оказалось, этот мутант был дефектен по развитию пыльцы, в связи с чем мутация получила название tpdl (от tobacco pollen development 1) [6]. Однако другие свойства этого интересного мутанта были изуче-
ны недостаточно полно, в связи с чем изучение tpd1-мутанта табака было продолжено.
Целью данной работы было проведение сравнительного изучения физиологических, морфологических и цитологических характеристик tpd1 -растений табака в процессе их роста и развития, а также выявление характера наследования измененного фенотипа.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служила трансгенная линия (tpdl) табака (Nicotiana tabacum L.) сорта Самсун, полученная в результате агробактери-альной трансформации в лаборатории Ю.Л. Дорохова в Институте физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ. Трансформирующий вектор был создан на базе плазмиды рВВД 19 и содержал, помимо целевой антисенс-последовательности, ген nptII (ген неомицинфосфотранс-феразы) под контролем промотора 35S CaMV (промотор гена 3 5S вируса мозаики цветной капусты) [6]. Материалом для исследования служили вегетирующие исходные растения и растения мутантного клона, выращенные in vitro на агари-зованной среде МС с 3%-ной сахарозой в факто-ростатной камере фитотрона на длинном (16 ч света + 8 ч темноты) дне при люминесцентном свете с интенсивностью 6-8 клк, температуре 25-27°С и влажности 80%.
Для подтверждения трансгенности этих растений был использован метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), позволяющий выявить nos-терминатор во встроенной конструкции ДНК, а также специализированный микрочип [7]. ДНК выделяли фенольным методом из растительного материала, замороженного в жидком азоте. Для проведения ПЦР использовали следующую пару праймеров на nos-терминатор: 5'-gAATCCTgT-TgCCggTCTTg-3' и 5'-TTATCCTTTgCgCgCTA-3'. Праймеры были синтезированы фирмой "Литех" (Россия). ПЦР проводили на амплификаторе Тер-цик фирмы "ДНК-технология" (Россия). Оптимизированная процедура ПЦР включала 40 циклов при температуре отжига 60°С. После прохождения ПЦР амплифицированные фрагменты ДНК подвергали электрофорезу в 2%-ном агарозном геле с бромистым этидием. Для ориентировочного определения размера ампликонов использовали набор фрагментов рестрицированной ДНК фага X с размерами от l0o до 1500 пар нуклеоти-дов (п.н.). В качестве положительного контроля ПЦР использовали ДНК трансгенного картофеля L2, полученного ранее в лаборатории роста и развития ИФР РАН, а в качестве отрицательного контроля - ДНК нетрансформированных растений табака сорта Самсун.
Наличие и экспрессию гена nptII выявляли по образованию каллусов и вегетативных почек на среде с канамицином в культуре in vitro. Для этого экспланты листьев помещали на агаризованную MC-среду с 2%-ной сахарозой, 1 мг/л 6-БАП, 0.1 мг/л ИУК, в присутствии или в отсутствие 200 мг/л канамицина.
Гибридные семена получали после опыления выращенных в почве tpdl -трансгенных и нетранс-генных растений собственной или чужой пыльцой. При этом семена образовывались только в случае опыления растений исходной формы собственной пыльцой, а трансгенной формы - только пыльцой исходных растений. Затем семена высевали на агаризованную MC-среду с 1%-ной сахарозой в присутствии или в отсутствие канамицина. Оценку устойчивости к канамицину проводили по подсчету полноценных зеленых (с хлорофиллом) проростков с развитой корневой системой.
Устойчивые к канамицину проростки трансгенных растений переносили на агаризованную MC-среду с 3%-ной сахарозой и канамицином в течение 3 пассажей. Проростки исходной формы с агаризованной среды без канамицина переносили на среду с 3%-ной сахарозой без канамицина также в течение 3 пассажей. Затем полученные таким способом растеньица из культуры in vitro пересаживали в почву. Далее растения выращивали с мая по октябрь в оранжерее при естественных освещении и температуре. Указанную процедуру повторяли с семенами последующих поколений.
По мере роста и развития растений отмечали сроки зацветания и продолжительность цветения. Определяли число цветков в соцветиях и их строение. В 5-10 цветках каждого варианта подсчитывали число тычинок, измеряли их длину, длину и массу пестиков, пыльников, диаметр микроспор на каждой стадии развития. Все наблюдения и измерения проводили на 5-10 растениях. Опыты проводили трижды в разные годы в летний вегетационный период.
Особенности развития женского и мужского гаметофитов, а также особенности клеточной организации листьев и пыльников изучали в среднем на 30 постоянных парафиновых препаратах, которые получали после фиксации пыльников, семяпочек и листьев по Карнуа [6]. Продольные срезы изготовляли на микротоме фирмы "Reichert" (Австрия), окрашивали после освобождения от парафина гематоксилином по Эрлиху [8, с. 265] и измеряли параметры клеток с помощью компьютерной программы Image Tool (California University, США). В таблицах представлены средние значения и их стандартные ошибки.
Рис. 2. Влияние канамицина (200 мг/л) на образование каллусов и морфогенез эксплантов листьев tpd1-трансгенной и исходной форм табака Самсун. 1, 2 - экспланты листьев исходной формы на среде без канамицина; 3, 4 - экспланты листьев исходной формы на среде с канамицином; 5, 6 - экспланты листьев трансгенной формы на среде без канамицина; 7, 8 - экспланты листьев трансгенной формы на среде с канамицином.
® 0
(б)
Рис. 1. Доказательства трансгенности tpdl -растений табака на основе анализа их ДНК. а - электрофореграмма продуктов ПЦР с праймера-ми на nos-терминатор на матрицах ДНК трансгенных и нетрансгенных растений. 1 - нетрансгенный табак (отрицательный контроль); 2 - трансгенный картофель линии L2 (положительный контроль); 3 - контрольная смесь без ДНК; 4 - tpdl -мутант табака; M -маркер длин ДНК (стрелкой обозначен фрагмент ДНК длиной 0.2 т.п.н.); б - анализ ДНК tpdl -растений с помощью специализированного биочипа. Светящиеся ячейки: верхний ряд - положительные контроли, которые подтверждают наличие растительной ДНК; ячейки во втором, третьем и четвертом горизонтальном рядах соответствуют последовательностям ДНК промотора 35S CaMV, гена wptlI и терминатора nos; тусклые ячейки пятого ряда являются отрицательными контролями (отсутствие гомологичн
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.