Генетика
Юрков А.П., кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственного микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук, доцент Российского государственного гидрометеорологического университета
Якоби Л.М., научный сотрудник Гапеева Н.Е., инженер- исследователь (Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной микробиологии Российской академии сельскохозяйственных наук) Шишова М.Ф., доктор биологических наук, профессор Санкт-Петербургского государственного университета
ОСОБЕННОСТИ РАЗВИТИЯ АРБУСКУЛЯРНОЙ МИКОРИЗЫ И ЕЕ УЛЬТРАСТУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ У СИЛЬНО МИКОТРОФНОЙ ЛЮЦЕРНЫ ХМЕЛЕВИДНОЙ И МУТАНТА С ОТКЛОНЕНИЯМИ В СИМБИОТИЧЕСКОЙ ЭФФЕКТИВНОСТИ1
Проведено исследование развития арбускулярной микоризы у сильно микотрофной линии MlS-1 люцерны хмелевидной и ее мутанта (линии III-1-18), образующего неэффективную дистрофную ар-бускулярную микоризу с грибом Glomus intraradices. Полученные данные свидетельствуют о том, что показатели микоризации у мутанта достоверно не отличаются от таковых у исходной линии на 20-е сут от посадки, однако встречаемость микоризы, обилие арбускул и везикул в микоризован-ной части были ниже у мутанта на 30-е и 50-е сут от посадки. При этом ультаструктурный анализ микоризы мутанта показал, что она не отличается от микоризы дикого типа. Вероятно, нарушения регуляции роста мутантной линии III-1-18 приводят к формированию дистрофичной микоризы, а, следовательно, к недостаточному снабжению микосимбионта углеводами в условиях низкого уровня доступного для питания растений фосфора в почве.
Ключевые слова: арбускулярная микориза, люцерна хмелевидная, Glomus intraradices, мутагенез, симбиотическая эффективность, ультраструктурный анализ.
DEVELOPMENT CHARACTERISTICS AND ULTRASTRUCTURAL ANALYSIS OF ARBUSCULAR MYCORRHIZA IN HIGH MYCOTROPHIC BLACK MEDIC AND MUTANT WITH DEFECTS IN SYMBIOTIC EFFICIENCY
The study of arbuscular mycorrhiza development in high mycotrophic MlS-1 black medic line and its mutant (III-1-18 line), which formed inefficient dystrophic arbuscular mycorrhiza with fungus Glomus intraradices, was carried out. Obtained data showed that mycorrhiza characteristics in mutant were not significantly different in compare with MlS-1 line at 20th day after sowing, however, at 30th and 50th day the frequency of mycorrhiza, arbuscule and vesicle abundances in mycorrhized parts were lower in mutant roots. According to the ultrastructural analysis mycorrhiza of mutant line had no differences in comparison with mycorrhiza of wild type plant. It was concluded that defects in regulation of growth in III-1-18 mutant line
i
© А.П. Юрков, Л.М. Якоби, Н Е. Гапеева, М.Ф. Шишова, 2014 г.
led to the formation of dystrophic mycorrhiza, and thus to the deficient supply of mycosymbiont by carbohydrates under conditions of low level phosphorus in soil available for plant nutritio.
Keywords: arbuscular mycorrhiza, black medic, Glomus intraradices, mutagenesis, symbiotic efficiency, ultrastructural analysis.
Введение. Арбускулярная микориза (АМ) - самая широко распространенная в природе ассоциация грибов и растений, в образовании которой могут принимать участие около 150 видов грибы из монофилетической группы - отдела Glomeromycota (SchüBler et al., 2001) и 80% видов из 92% семейств наземных растений (Смит, Рид, 2012). Грибы АМ являются облигатными симбиотрофами, получают от растения необходимые углеводы и имеют надежную нишу для существования. Они колонизируют межклетники и клетки коры корня и в дальнейшем, развивая внекорневой мицелий, снабжают растение-хозяина питательными элементами такими как: цинк, медь, азот в виде аммония, кальций, магний, калий и особенно фосфор, а также снабжают растения водой (Смит, Рид, 2012). Обмен углеводами и минеральными питательными веществами в АМ должен контролироваться обоими партнерами с целью устойчивого эволюционно стабильного мутуализма. Исследования подтверждают существование тесной функциональной связи между углеродным и фосфорным обменами в АМ (Hammer et al., 2011). Несмотря на значительные успехи в изучении АМ, остаются до конца не выясненными механизмы, лежащие в основе ее эффективности. Кроме того, для исследования механизмов АМ-эффективности используются в основном мутанты, характеризующиеся дефектами в формировании различных стадий развития АМ. На таких модельных растениях (например, мутантах люцерны слабоусечённой - Medicago truncatula) в настоящее время активно исследуется общий сигналлинг ризобиального и микоризного симбиоза (Horvath et al., 2011; Ivanov et al., 2012). Для детального исследования основных механизмов эффективности АМ, на наш взгляд, целесообразно использовать модельные системы, включающие высокоэффективный АМ-гриб и сильно микотрофное в оптимальных для развития АМ условиях растение. Оптимальными условиями для развития АМ, как известно, является низкий уровень доступного для питания растений фосфора (Рд) в почве (Смит, Рид, 2012). Именно в этих условиях максимально проявляется основное действие микобионта на растение-хозяина - усиление фосфорного питания за счет симбиотрофного и/или автотрофного его поступления. Проведенные нами ранее исследования позволили отобрать необходимое модельное растение - люцерну хмелевидную (Medicago lupulina L. var. vulgaris Koch) (Юрков и др., 2007). Исходная линия MlS-1 получена в результате индивидуального отбора из примитивного сорта ВИК-32. Она образует микоризу Arum-типа и имеет нормальный фенотип АМ с Glomus intraradices, формируя как внутриклеточные арбускулы, так и межклеточные везикулы в коре корня (Myc) (Куренков и др., 2013). При выращивании на почве с низким уровнем доступного для питания растений фосфора (Рд) без микоризации линия MlS-1 имеет признаки карликовости (ограниченный рост стебля, слабое или полное отсутствие бокового ветвления, мелкая листовая пластинка, тонкий стебель) и гиперотзывчива на инокуляцию грибом. На данном растении получены мутанты, с применением которых проводятся исследования механизмов, контролирующих симбиотическую эффективность АМ (Юрков, Якоби, 2011). В процессе исследований выделена мутантная линия III-1-18 - специфический мутант, образующий неэффективную микоризу с G. intraradices, но при этом способный к формированию нормального азотфиксирующего симбиоза в ассоциации с Sinorhizobium meliloti (Куренков и др., 2013). Мутант хорошо отзывается на внесение фосфорного удобрения, т.е. способен к автотрофному фосфорному питанию при высоком содержании Рд в почве.
В связи с вышеперечисленным цель настоящего исследования заключалась в изучении особенностей развития арбускулярной микоризы и осуществление ультраструктурного ана-
лиза сильно микотрофной линии MlS-1 M. lupulina и мутантной линии III-1-18, формирующей неэффективную микоризу с G. intraradices.
Материалы и методы. Растительный материал. Мутантная линия III-1-18 люцерны хмелевидной. В качестве варианта сравнения использована исходная экологически облигат-но микотрофная в условиях низкого уровня Рд в почве линия люцерны хмелевидной MlS-1.
Грибной материал. Для инокуляции растений с целью образования арбускулярной микоризы используется гриб G. intraradices Shenck&Smith - изолят RCAM00320 из коллекции лаборатории экологии симбиотических и ассоциативных микроорганизмов ВНИИСХМ. Данный штамм был выделен в 1980-е гг. из дерново-подзолистой почвы Ленинградской области (Якоби и др., 2000). Гриб является облигатным симбиотрофом, поэтому в лабораторных условиях поддерживается на плектрантусе (Plectranthus australis L), согласно методическим разработкам А.П. Юрков с соавт. (Юрков и др, 2007, 2010). Для инокуляции растений были взяты микоризованные корни плектрантуса в возрасте 6 мес. Такие же корни, но без микоризы были взяты для контрольных вариантов.
Методика вегетационного эксперимента описана в работе А.П. Юркова с соавт. (Юрков и др., 2007). Температура воздуха днем - +25°С, ночью - +18°С. Смена режима день/ночь -16ч/8ч, соответственно. Уборка растений - на 55 сут от посадки проростков. Минимальная биологическая повторность опытов составила 12 растений.
Микроскопический анализ развития АМ проведен с применением метода окрашивания образцов корней, разработанного Дж. Филлипсом и Д. Хейманом для оценки АМ-инфекции в корнях бобовых растений (Phillips, Hayman, 1970). При оценке основных количественных и качественных характеристик АМ использован метод световой микроскопии (Trouvelot et. al., 1986) и разработанная А.П. Юрковым компьютерная программа «Mycorrhiza». Оценены такие показатели, как: F - встречаемость микоризной инфекции в корне; M и m - интенсивность микоризации в расчете на весь корень и на микоризованную часть корня, соответственно; A и a - обилие арбускул в корне и в микоризованной части корня, соответственно; B и b - обилие везикул в корне и в микоризованной части корня, соответственно.
Трансмиссонная электронная микроскопия ультратонких срезов микоризованных корней люцерны проведена с использованием методики, примененной Л.М. Якоби с соавт. (Jacobi et al., 2003) с незначительными модификациями. Образцы (1-см фрагменты корней тщательно отмытые водой) фиксировали в течение 3ч в 2,5% глутаральдегиде на 0,1М натрий-какодилатном буфере (pH=7,2). После трехкратной промывки по 20 мин в том же буфере, образцы подвергали пост-фиксации в течение 3 ч в 1%-м тетроксиде осмия на 0,1 М какоди-латном буфере (с pH исходного буфера, доведенного 1%-й HCl до 7,4). После новой промывки следовало обезвоживание образцов в этиловых спиртах: 30%, 50% и 70%, в каждом по
2 раза по 10 мин. Затем проводили контрастирование в 2% уранил-ацетате на 70% спирте в течение 2,5 ч при комнатной температуре. Далее продолжали обезвоживание в 85%, 90%, 96% спирте - по 15 мин, и в 100% спирте дважды по 30 мин. После образцы помещали в смесь 100% спирта и абсолютного ацетона (1:1) на 20 мин, затем в абсолютный ацетон -
3 раза по 20 мин. Далее проводили дробную проводку образцов в смеси ацетона и смеси смол (Epon 812, Epon Harter DDEA, Арал Aral
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.