НЕЙРОХИМИЯ, 2013, том 30, № 1, с. 71-78
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.8
ОСОБЕННОСТИ РЕАКЦИИ НЕЙРОНОВ И ГЛИАЛЬНЫХ КЛЕТОК ВЕНТРО-МЕДИАЛЬНОЙ РЕТИКУЛЯРНОЙ ФОРМАЦИИ ПРОДОЛГОВАТОГО МОЗГА КРЫСЫ НА ОСТРУЮ БОЛЬ © 2013 г. И. В. Манжуло1' *, О. С. Огурцова1, И. В. Дюйзен1' 2, Н. Е. Ламаш1' 3
Учреждение Российской академии наук Институт биологии моря им. А.В. Жирмунского
Дальневосточного отделения РАН, Владивосток, Россия 2Школа биомедицины, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия 3Школа естественных наук, Дальневосточный федеральный университет, Владивосток, Россия
Проведено исследование динамики нейрохимических перестроек нейронов и глиальных клеток вентро-медиальной ретикулярной формации продолговатого мозга крысы при развитии острой воспалительной боли. Показано, что в вентро-медиальной ретикулярной формации при развитии болевой реакции число нейронов, экспрессирующих NADPH-диафоразу, увеличивается в 2 раза по сравнению с нормой. Установлено, что спустя 2 ч после развития болевой реакции наблюдается увеличение количества тирозин-гидроксилаза — позитивных элементов в 1.5 раза по сравнению с нормой. Развитие острой боли сопровождается также реакцией со стороны глиальных элементов ядра — активность зрелых астроцитов увеличивается в 1.9 раза, а площадь иммуногистохимического окрашивания микроглии уменьшается в 7.6 раза по сравнению с нормой. Результаты настоящего исследования свидетельствуют о том, что при развитии острой болевой реакции происходит активация не только нейронов вентро-медиального ядра ретикулярной формации, но и глиальных элементов.
Ключевые слова: нейроны, глия, вентро-медиальная ретикулярная формация, острая боль.
DOI: 10.7868/S102781331301007X
ВВЕДЕНИЕ
Ядра ретикулярной формации (РФ) головного мозга, обеспечивающие огромное многообразие нейропсихических, когнитивных и нейровегета-тивных процессов, в последнее время рассматривают как важнейшее звено регуляции сенсорных функций и их сопряжения с обще-соматическими реакциями адаптации и обучения [1]. Ростральное вентро-медиальное ядро (РВМЯ) считается одним из важных компонентов системы болевого контроля и до настоящего времени нейрональные механизмы их функционирования являются объектом широких дискуссий [2]. Располагаясь в ростральных отделах продолговатого мозга, нейроны вентральной ретикулярной формации имеют обширные проекции на клетки спинного мозга, воспринимающие болевую импульсацию, так и с ядрами ствола, участвующими в модуляции болевого сигнала и организации вегетативных адаптаций к боли. Особенности афферентно-эффекторной организации нейронов РВМЯ позволяют им, с одной стороны, обслуживать экстралемнисковую систе-
* Адресат для корреспонденции: 690059 Приморский край, Владивосток, ул. Пальчевского, 17; тел. 8(423) 231-04-63; e-mail: i-manzhulo@bk.ru.
му болевого анализатора и участвовать в формировании болевой реакции [3]. С другой стороны, за счет обширных нисходящих проекций в спинной мозг они координируют выраженность болевого синдрома, выступая в роли эндогенного антиболевого центра [4]. Основу для такого двойственного эффекта формируют морфологически и нейрофи-зиологически разнородные популяции клеток, механизмы функционирования и нейрохимическое устройство которых в настоящее время активно изучаются во всем мире. В этой связи нейромедиа-торное обеспечение антиболевых механизмов являет собой эффективную терапевтическую мишень для дифференцированного купирования различных болей в клинической практике [5].
Последние исследования подтверждают важную роль глии в развитии болевых реакций. Показано, что глиальные элементы сегментарных центров боли (спинальных ганглиев и задних рогов спинного мозга) претерпевают выраженные мор-фо-химические изменения при развитии болевой реакции [6—9]. Однако вопрос об участии супрас-пинальных глиальных систем (в частности, ядер вентральных отделов ретикулярной формации продолговатого мозга) в модуляции острого боле-
вого сигнала, до настоящего времени остается открытым.
В этой связи целью настоящего исследования явилось изучение динамики нейрохимических перестроек нейронов и глиальных клеток вентральных отделов ретикулярной формации продолговатого мозга крысы при развитии острой воспалительной боли.
МЕТОДИКА
Характеристика экспериментального материала. В настоящей работе была использована одна из наиболее распространенных экспериментальных моделей, которая позволяет изучать механизмы острой воспалительной боли. Воспалительная боль сопровождается у животных физиологическими, морфологическими и нейрохимическими перестройками, патогенетически сходными с клиническими болевыми синдромами, в частности — послеоперационной болью. Это позволяет рассматривать болевое воздействие, вызванное введением формалина в периферические ткани, как наиболее адекватный метод для исследования фундаментальных механизмов соматической боли и более уверенно экстраполировать результаты экспериментальных исследований на условия клиники [10].
Работа выполнена на крысах-самцах со средним весом 250 г, животные были разделены на две группы (по 9 животных в каждой) — группа "контроль" и группа "боль". Для формирования воспалительного болевого процесса крысам в подошву задней правой лапы подкожно вводили 0.2 мл 4%-ного параформальдегида, приготовленного на 0.1 М фосфатном буфере (рН 7.2). Животным контрольной группы в лапу вводилось аналогичное количество физиологического раствора. Животных усыпляли через 2 ч после нанесения болевого воздействия.
Мониторинг поведенческой активности проводили по общепринятой методике [11], оценивая выраженность специфических болевых реакций — длительности лизания поврежденной конечности и числа встряхиваний поврежденной лапой и всем телом.
Исследования на животных проводили в соответствии с Правилами проведения работ и использования экспериментальных животных (Приложение к приказу МЗ СССР № 755 от 12.08.1977г.). Животных содержали в виварии в соответствии с "Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник" (от 6.04.1993 г.), кормили в соответствии с нормами. Для эвтаназии использовался общий наркоз путем внутрибрюшинного введения
3%-ного тиопентала натрия, после чего животных декапитировали.
Гистохимическое выявление активности NADPH-диафоразы. Гистохимический метод состоит из двух этапов: 1. Фиксация кусочков ткани (4%-ный параформальдегид, приготовленный на 0.1М фосфатном буфере (рН 7.2)) в течение 4 ч и их последующая промывка. 2. Обработка срезов в инкубационной среде. Серийные срезы толщиной 50 мкм изготавливали во фронтальной плоскости на криостате. Срезы в планшетах помещали в инкубационную среду и инкубировали 1 ч при 37°С. Состав инкубационной среды был следующим: 50 мМ буфер Трис-HCl, 0.2%-ный Тритон X-100, 0.8 мг/мл NADPH, 0.4 мг/ мл НСТ; рН 8.0 [12]. После инкубации срезы трижды промывали в дистиллированной воде, вылавливали на предметные стекла, обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам.
Иммуноцитохимические методы исследования. Для оценки медиаторного профиля нейронов и глиальных клеток ВРФ использовали метод имму-нопероксидазной реакции выявления тирозин-гидроксилазы (ТН), нейрональной формы NO-синтазы (nNOS), интегрина альфа (OX-42) и гли-ального фибриллярного кислого белка (GFAP). Этот метод включает несколько последовательных этапов: прединкубация, обработка в растворе первичных антител, обработка вторичными антителами и постановка иммунопероксидазной реакции. В работе использованы первичные поликлональ-ные мышиные и кроличьи антитела против GFAP (Vector Laboratories G 805, США), OX-42 (Santa Cruz sc-53086, США), TH (Vector T 489, США), nNOS (ICN 11735, США) в разведении 1 : 100, 1 : 50, 1 : 30 и 1 : 1000 соответственно. Вторичные биотинилированные антитела, комплекс авидин-биотина, а также хромоген были получены от фирмы Vector Laboratories и использовались в соответствии с инструкциями фирмы производителя.
Криостатные срезы толщиной 50 мкм после трех промывок в 0.1М фосфатном буфере (рН 7.2) обрабатывали в течение 60 мин в 2%-ном растворе бычьего сывороточного альбумина и 0.25%-ного Тритона Х-100. Для проведения иммуноперокси-дазного окрашивания срезы дополнительно инкубировали в 3%-ном растворе перекиси водорода для блокирования эндогенных пероксидаз. Инкубация с первичными антителами в соответствующих концентрациях проводилась в 24 луночных планшетах при 4°С в течение 24 ч. Затем срезы инкубировали в течение 60 мин в растворе вторичных антител. При проведении иммунопероксидазной реакции после отмывки вторичных антител препараты погружали на 30 мин в раствор стандартного АВС-комплекса (Vectastain Elite ABC kit, Vector Labs, США) и затем в течение 5—10 мин обрабаты-
вали хромогеном (NovaRED substrate kit (SK-4800), SG substrate kit (SK-4700), Vector Labs, США) на 0.1 М фосфатном буфере (pH 7.2). Затем срезы тщательно отмывали в буфере, обезвоживали и заключали в бальзам по общепринятой методике.
Общеморфологические методы исследования. Определение общего количества нейронов в РВМЯ производили при окрашивании по Нисслю. Для этого каждый шестой срез, получаемый при изготовлении серии для проведения гисто- или имму-ноцитохимической реакции, окрашивали галло-цианин-хромовыми квасцами (0.15%-ный раствор галлоцианина на 5%-ном растворе хромовых квасцов), после чего срезы обезвоживали в спиртах и заключали в бальзам по традиционной методике. Препараты просматривали в световом микроскопе DM 4500B (Leica, Великобритания) и фотографировали при помощи цифрового фотоаппарата DFC300 FX (Leica, Великобритания).
Количественная обработка данных. Подсчет числа нейронов производили в 20—25 последовательных серийных срезах продолговатого мозга. Учитывали абсолютное количество гисто- или им-мунопозитивных клеток и высчитывали их долю из числа нервных клеток, окрашенных в сходных областях по методу Ниссля. Определение удельной плотности распределения нейронов производили с использованием пакета программ ImageJ 1.41. Оценку площади иммуногистохимического окрашивания глиальных элементов проводили на срезах прод
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.