ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 5, с. 751-758
УДК 581.1:584.032
ОСОБЕННОСТИ РЕГУЛЯЦИИ МЕЖКЛЕТОЧНОГО ВОДООБМЕНА В РАЗНЫХ ЗОНАХ КОРНЯ КУКУРУЗЫ В УСЛОВИЯХ ОСМОТИЧЕСКОГО И ГОРМОНАЛЬНОГО СТРЕССОВ
© 2004 г. О. В. Волобуева*' **, Г. А. Великанов*, Ф. Балушка***
* Казанский институт биохимии и биофизики Казанского научного центра Российской академии наук, Казань
** Казанский государственный университет, Казань *** Боннский университет, Ботанический институт, Бонн, Германия Поступила в редакцию 07.07.2003 г.
Исследование проведено на апикальной меристеме и отрезках корней из зоны растяжения 4-5-дневных проростков Zea mays L. Для визуализации вакуолярной АТФазы и пирофосфатазы как маркеров тонопласта, а также а-, 5- и у-аквапоринов тонопласта использована методика непрямой имму-нофлуоресцентной микроскопии с применением соответствующих антител. После плазмолиза клеток (маннит 700 мМ, 2.5 ч) вакуолярная АТФаза и пирофосфатаза, являющиеся белками тонопласта, были обнаружены в каналах клеточных стенок, содержащих плазмодесмы, после их отрыва от плазмо-лизированных клеток. Это служит новым доказательством существования вакуолярного симпласта в зоне растяжения корня кукурузы, обеспечивающего межклеточную непрерывность растительной ткани. Для исследования самодиффузии молекул воды применяли импульсный метод ЯМР. Диффузионное затухание в зоне растяжения корня было неэкспоненциальным и разделялось на три экспоненты со своими коэффициентами самодиффузии, два из которых (D2 и D3) характеризуют самодиффузию воды в цитоплазматическом и вакуолярном симпластах корня соответственно. Апикальную меристему корня исследовали также методом ЯМР с парамагнитным допингом апопласта, который позволяет наблюдать диффузию воды только по симпласту ткани. Изучено влияние осмотического стресса (ПЭГ-6000, 12 и 20%, 2.5 ч) и стрессоров химической природы (АБК и салициловой кислоты, 0.1 мМ, 24 ч) на водопроницаемость плазмодесм и аквапоринов тонопласта. При действии всех стрессоров в меристеме корня увеличивалась трансклеточная водопроницаемость. В зоне растяжения при действии осмотического стресса преобладающим становился апопластный водообмен, действие же других стрессоров различалось: АБК увеличивала водопроницаемость вакуолярного симпласта, а салициловая кислота, напротив, снижала водопроводимость как цитоплаз-матического, так и вакуолярного симпласта.
Zea mays - плазмодесмы - аквапорины - водопроницаемость - регуляция - иммунофлуоресцентная микроскопия - ЯМР
Водообмен в растительных тканях может осуществляться тремя путями: 1) по апопласту - свободному пространству тканей, включающему межклетники, каналы между микрофибриллами целлюлозы клеточных стенок, сосуды ксилемы;
2) по симпласту, включающему в себя протопласты всех клеток, объединенных межклеточными каналами - плазмодесмами - в единую систему;
3) по трансмембранному пути - из клетки в клет-
Сокращения: ДМСО - диметилсульфоксид, ПМД - парамагнитный допинг, D - коэффициент самодиффузии, PBS - фо-сфатно-солевой буфер, PIPES - пиперазин-N, №-бис[2-этил-сульфоновая кислота], TIPs - аквапорины тонопласта. Адрес для корреспонденции: Волобуева Ольга Васильевна. 420111 Казань-111, а/я < 30. Казанский институт биохимии и биофизики КНЦ РАН. Электронная почта: olga.volobuyeva@ksu.ru
ку с выходом через вакуоли и плазматическую мембрану в межклеточное пространство.
Плазмодесмы, выстланные плазматической мембраной, содержат и центральный элемент -полую десмотубулу, образованную мембраной эндоплазматического ретикулума [1], способную переходить в другие эндомембраны, что обеспечивает единое мембранное пространство растительной ткани [2, 3]. Предполагается, что проницаемость плазмодесм может активно регулироваться за счет функционирования АТФ-зависимого сфинктера, расположенного в шейных сужениях плазмодесм [4-6], и/или за счет быстрых обратимых отложений каллозы в клеточной стенке вокруг плазмодесм [4]. Ранее, используя метод ЯМР, мы получили косвенные доказательства выдвинутой Гамалеем [3] гипотезы о существовании двух транспортных каналов в плазмодесмах [5, 7]. Есть основание говорить о наличии в расти-
тельной ткани двух симпластных систем - цито-плазматической и вакуолярной.
Главным препятствием в трансклеточном пути воды являются мембраны. В последние годы установлено, что вода движется через биологические мембраны не только через липидный бислой, но и через специфические белки - аквапорины, присутствующие как в животных, так и в растительных мембранах [8]. Аквапорины растительных клеток представляют собой семейство интегральных мембранных белков с мол. м. 20-27 кД и подразделяются на два подсемейства - аквапорины плазматической мембраны (по классификации англоязычной литературы - РШв) и аквапорины тонопласта (ПРв) [9]. С открытием аквапори-нов встал вопрос об их значении для радиального транспорта воды в корне. Появилось предположение о том, что в некоторых условиях радиальный поток воды в корне может быть, главным образом, трансклеточным [10, 11] и может контролироваться изменением плотности аквапоринов в мембране, а также посредством их открывания/закрывания [10, 12].
Установлено, что преобладание того или иного пути транспорта воды зависит от вида растения, стадии его развития, а также от движущей силы абсорбции воды - гидростатического или осмотического градиентов [13, 14]. При высокой скорости водного потока (открытые устьица, низкая относительная влажность воздуха) вода в основном перемещается по апопласту, которому присуще меньшее гидравлическое сопротивление. И наоборот, когда водный поток небольшой, апопластный транспорт незначителен [15, 14] и большая часть водного потока идет по трансклеточному пути, включающему трансмембранный перенос воды и транспорт по плазмодесмам [16]. В зарубежной литературе, как правило, не выделяют отдельно транспорт воды по плазмодесмам и через клеточные мембраны и называют эти две составляющие водного транспорта "из клетки в клетку" (ееП-Ю-ееП), что связано с методическими сложностями в разделении этих двух путей [17].
Известно, что гидравлическая проводимость корня может изменяться при различных абиотических стрессах, таких как засоленность, аноксия, температурный стресс. Причем значительная роль в ее регуляции в последнее время отводится аквапоринам [17-19].
В настоящей статье предпринята попытка анализа изменений (регуляции) водопроницаемости аквапоринов и плазмодесм в различных зонах корня кукурузы при действии водного стресса и стрессоров химической природы - АБК и салициловой кислоты. Кроме того, в задачу входило получение данных, подтверждающих существование вакуолярного симпласта, обеспечивающего,
наряду с цитоплазматическим симпластом, межклеточную непрерывность растительной ткани.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили корни 4-5-дневных этиолированных проростков кукурузы (Zea mays L.). Семена замачивали в течение 8 ч в проточной воде, затем помещали в увлажненную, свернутую рулоном фильтровальную бумагу и выращивали в темном термостате при 25°С. Осмотический стресс создавали, помещая корни ин-тактных проростков на 2.5 ч в растворы осмотика ПЭГ-6000 (12 и 20%), создающие соответственно слабый и средний осмотический водный стресс (потеря воды - 5 и 10%). Чтобы вызвать плазмолиз, также применяли маннит (700 мМ, "Sigma", США). Обработку стрессорами химической природы - фитогормоном АБК (0.1 мМ, "Sigma") и салициловой кислотой (0.1 мМ, "Sigma") проводили в течение 24 ч. Для измерений брали две зоны корня - зону меристемы, составляющую 1.5-2 мм от кончика корня, и зону растяжения, лежащую в пределах 8 мм от кончика корня [20].
Для исследования самодиффузии воды в тканях корня использовали метод спинового эха ЯМР с импульсным градиентом магнитного поля [21]. В настоящей работе регистрировали относительную амплитуду эха (R) в зависимости от квадрата градиента магнитного поля (g2) при фиксированных значениях длительности градиентных импульсов (5) и времени наблюдения диффузии (td = = 100 мс). Коэффициенты самодиффузии (D) рассчитывали по формуле: lnR = -y252g2tdD, где у -константа (гиромагнитное отношение протона), а D - коэффициент самодиффузии молекул воды. Методика регистрации D воды в исследуемых корнях изложена нами в [5, 21].
Ранее нами была объяснена природа D, получаемых в результате разложения диффузионного затухания в корне на три экспоненты с соответствующими Di [5]. Самый высокий по величине коэффициент (D3) характеризует усредненно самодиффузию воды в системе вакуолярного симпласта и апопласта, а средний (D2) - в системе цитоплазматического симпласта корня. Медленно спадающая часть трехкомпонентного диффузионного затухания дает коэффициент самодиффузии (Dx), независимый от времени наблюдения диффузии, который в контексте настоящей статьи не применяется. Однако в настоящей работе использован методический прием, позволяющий исключить из рассмотрения перенос воды по апопласту и наблюдать перенос воды только по сим-пласту ткани (так называемый метод парамагнитного допинга (ПМД)) [23, 24]. Суть этого приема заключается в том, что измерение диффузионного смещения молекул воды по объему образца проводится после предварительного внедрения во
внеклеточное пространство парамагнитных ионов высокой релаксационной эффективности, не проникающих (или медленно проникающих) в клетки. В результате наблюдаемый диффузионный пробег локализуется в пределах симпласта, поскольку при выходе из клетки молекулы воды становятся невидимыми с точки зрения наблюдения ЯМР-сигнала из-за быстрой релаксации в присутствии парамагнитных ионов, а входящие молекулы уже лишены намагниченности. В качестве парамагнитных ионов мы использовали ионы марганца. Экспозиция в растворе 2.5 мМ MnCl2 - 15 мин.
Корни слегка обсушивали фильтровальной бумагой, нарезали на сегменты: 2 мм от кончика корня (зона меристемы) и следующие 5-6 мм (зона растяжения). Образцы из зоны растяжения помещали в датчик диффузометра так, что градиент магнитного поля был направлен параллельно радиусу корня, что позволяло регистрировать самодиффузию воды в этом направлении. Образцы из зоны мер
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.