МИКРОБИОЛОГИЯ, 2008, том 77, № 4, с. 502-507
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 582.281.123.2.017.735:547.92
ОСОБЕННОСТИ РОСТА И БИОСИНТЕЗА РУГУЛОВАЗИНОВ У ГРИБОВ PENICILLIUM VARIABILE SOPP 1912
© 2008 г. Т. В. Антипова, В. П. Желифонова, Г. А. Кочкина, А. Г. Козловский1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 04.06.2007 г.
Способность грибов вида Pénicillium variabile синтезировать клавиновые алкалоиды - ругуловазины не зависела от места обитания продуцентов. При глубинном культивировании на простой синтетической среде на ранних стадиях роста у исследованных грибов наблюдался микроциклический ко-нидиогенез, наличие или отсутствие которого, а также активность культур в отношении биосинтеза ругуловазинов определялись составом среды культивирования. На сложной среде, содержащей добавки пептона, конидиогенез имел место, но был значительно подавлен. На среде с дрожжевым экстрактом конидии полностью отсутствовали. При этом в обоих случаях заметных количеств ругуловазинов не было обнаружено.
Ключевые слова: микроскопические грибы, Pénicillium, микроциклический конидиогенез, биосинтез, вторичные метаболиты, клавиновые алкалоиды, ругуловазины.
Грибы рода Pénicillium являются перспективными объектами для поиска новых биологически активных соединений [1]. Особый интерес представляют изоляты, выделенные из малоизученных необычных местообитаний. Ранее среди грибов, относящихся к роду Pénicillium, выделенных из древних многолетнемерзлых отложений были отобраны новые продуценты новых вторичных метаболитов, таких как хинолиновые алкалоиды -хиноцитринины [2], и были найдены новые продуценты важных биологически активных соединений - эргоалкалоидов, дикетопиперазинов группы рокефортина [3, 4]. В ходе этих исследований было установлено, что грибы-реликты вида P. variabile Sopp синтезируют необычные для этого вида клавиновые алкалоиды - ругуловазины [5]. При изучении процессов роста и развития одного из штаммов-реликтов P. variabile ВКМ FW-806 на среде определенного состава был обнаружен необычный для продуцентов, относящихся к роду Penicillium, микроциклический конидиогенез.
Цель работы - изучить возможную связь между способностью грибов P. variabile синтезировать ругуловазины с их местообитаниями, установить ключевые факторы, определяющие характер роста и развития продуцентов, а также направление и интенсивность биосинтеза вторичных метаболитов.
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: Kozlovski@ibpm.pu-shchino.ru).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штаммы Pénicillium variabile, полученные из Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, ВКМ F-2075, FW-806, FW-899, FW-1449, FW-1451, FW-1452, FW-2528, FW-2531, FW-2566, FW-2701, FW-2758, FW-2762, FW-2884, FW-2886. При изучении процессов роста и развития, а также биосинтеза ругуловазинов посев проводили из водной суспензии спор 14-суточных культур, выращенных на сусло-агаре, на среду следующего состава (г/л дистиллированной воды): маннит - 50.0; янтарная кислота - 5.4; MgSO4 ■ ■ 7H2O - 0.3; KH2PO4 - 1.0; рН доводили до 5.4 25%-ным раствором NH4OH (контрольная среда).
Кроме того, штамм ВКМ FW-806 дополнительно культивировали на трех средах: контрольная среда с добавкой ZnSO4 ■ 7h2O (4.4 мг/л) (среда 1), с добавкой дрожжевого экстракта и с добавкой пептона в концентрации по 0.5 г/л ("Б1Гсо", США) (среды 2 и 3). Для изучения возможного влияния ругуловазинов на дифференцировку грибов в среду 2 вносили ругуловазины в концентрации 3.3 мг/л при посеве или на 7 сут, а затем на 11 сут роста.
Штаммы культивировали в 150 мл среды в колбах объемом 750 мл при 24 ± 1°С на качалке (220 об/мин). При изучении продукции ругуловазинов культурами отбор проб проводили на 7 и 14 сут роста, а при изучении возможной взаимосвязи биосинтеза ругуловазинов и конидиогенеза - на 5, 6, 8 и 13 сут. Определение интенсивности конидиооб-разования проводили ежесуточно [6]. Рост оцени-
вали по изменению массы сухого мицелия в процессе культивирования. Метаболиты извлекали из фильтрата культуральной жидкости трехкратной экстракцией хлороформом (об/об) по ранее описанной методике [3].
Анализ экстрактов осуществляли методом ТСХ на пластинках силикагеля (Silicagel 60 F254, "Merck", Германия) в системах растворителей хлороформ : метанол : 25%-ый NH4OH - 90 : 10 : 0.1 (система I), 90 : 10 : 1 (система II), 80 : 20 : 0.2 (система III) и хлороформ : ацетон : метанол - 93 : 7 : 5 (система IV). Ругуловазины обнаруживали по поглощению в УФ-свете и после опрыскивания пластин реактивами Эрлиха и Драгендорфа.
Для дальнейшего выделения и очистки ругуло-вазинов использовали препаративную ТСХ на пластинах силикагеля. Идентификацию метаболитов осуществляли сохроматографией в различных системах со стандартными образцами, полученными ранее в лаборатории вторичных метаболитов ИБФМ РАН, используя специфические реактивы Эрлиха, Драгендорфа и другие данные физико-химических методов. Количественное содержание ругуловазинов в образцах определяли по ранее описанной методике [5].
УФ-спектры соединений в метаноле получали на спектрофотометре UV-160 А ("Shimadzu", Япония).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В результате изучения низкомолекулярных азотсодержащих вторичных метаболитов, синтезируемых штаммами-реликтами вида P. variabile ВКМ FW-655, FW-806, FW-811, FW-816, FW-818, выделенными из многолетнемерзлых отложений, было установлено, что все они синтезируют идентичный набор клавиновых алкалоидов - ругулова-зин А и его изомер ругуловазин Б [5]. К настоящему времени эти соединения обнаружены у отдельных представителей грибов рода Pénicillium, относящихся к двум подродам - Pénicillium и Biver-ticillium [7, 8]. У вида P. variabile Sopp ругуловазины были обнаружены впервые. Штаммы этого вида, выделенные из современных мест обитания, ранее были известны как продуценты микотокси-нов поликетидной природы - охратоксина А и ру-гулозина [7, 8].
Известно, что физиолого-биохимические характеристики штаммов грибов, в том числе и спектр синтезируемых ими вторичных метаболитов, могут зависеть от местообитания, из которого выделен конкретный изолят. Поскольку все новые продуценты ругуловазинов были изолированы из многолетнемерзлых отложений, было важно проверить, насколько распространена способность синтезировать эти вторичные метаболиты
среди штаммов, относящихся в виду Р. уапаЪйе, и, в первую очередь, выделенных из других местообитаний. В связи с этим был проведен скрининг среди 13 штаммов, выделенных в разных географических зонах из различных местообитаний (табл. 1). В результате изучения спектра метаболитов, синтезируемых этими культурами, было установлено, что пять штаммов Р. уапаЪИв ВКМ F-2075, FW-2528, FW-2531, FW-2701 и FW-2758 продуцировали идентичный набор клавиновых алкалоидов -метаболит 1 и метаболит 2. На основании физико-химических характеристик полученных метаболитов (табл. 2), которые практически совпали с литературными данными для заведомых образцов [5], они были идентифицированы как ругуловазин А (метаболит 1) и ругуловазин Б (метаболит 2). Все пять штаммов, синтезирующих ругуловазины, были выделены из современных местообитаний. Следует отметить, что география распространения продуцентов и конкретные места их обитания разнообразны (табл. 1). Так, штаммы FW-2528, FW-2531, FW-2701 были изолированы недавно из экстрактов биологически активных веществ природного происхождения, поступивших из Южной Америки. Штамм F-2075, длительное время хранящийся во Всероссийской коллекции микроорганизмов ИБФМ РАН, был выделен из жидкого топлива во Вьетнаме, а штамм FW-2758 представляет собой современный изолят с воскового фонографического валика, хранящегося в Литературном музее г. Москвы почти столетие. У остальных изученных в данной работе культур, в том числе, изолированных из древних многолетнемерзлых отложений Арктики и Антарктики, биосинтез ругуловазинов обнаружен не был. Ранее продукция этих алкалоидов была впервые установлена у пяти штаммов Р. уапаЪИе, изолированных из древних многолетнемерзлых отложений Арктики [1]. Следует отметить, что уровень накопления ругуловазинов у штаммов, изолированных из современных мест обитания, был в 3-7 раз выше по сравнению с самым активным из изученных ранее штаммов-реликтов - Р. уапаЪйе ВКМ FW-806 (0.6 мг/л) [5].
Таким образом, способность к синтезу ругуловазинов достаточно широко распространена у пени-циллов вида Р. уапаЪйе. Учитывая то, что география распространения и источники выделения штаммов-продуцентов довольно разнообразны можно сделать вывод о том, что наличие или отсутствие продуцентов ругуловазинов среди культур этого вида не зависят от места обитания изолята.
Наблюдение за морфологией грибов вида Р. уапаЪИе в процессе глубинного культивирования на минеральной среде показало наличие диф-ференцировки мицелия с формированием кони-дионосных структур и конидий у всех штаммов. У культур также наблюдали прорастание вторичных конидий и развитие вторичного микроциклическо-
Таблица 1. Биосинтез ругуловазинов и время формирования микроциклического конидиогенеза (МЦК) у грибов вида Р. уапаЪИе Борр, выделенных из различных местообитаний
Штамм ВКМ Место выделения Источник выделения Ругуловазины, мг/л МЦК, сут
Б-2075 Вьетнам Жидкое топливо 3.9 5 сут
^-2528 Южная Америка Продукт переработки алкалоидсо-держащего растительного сырья 4.1 »
^-2531 Южная Америка Алкалоид растительного происхождения (образец 7) 1.6 »
^-2701 Южная Америка Алкалоид растительного происхождения (образец 47) 3.7 »
^-2758 Москва, Литературный музей Фрагмент фонографического валика № 6, светло-коричневый воск 3.0 »
^-899 Арктика, Колымская низменность, скважина17/99 Вода криопэга с примесью верхних слоев грунта, глубина 17.0-17.3 м, возраст 100-120 тыс. лет 0 11 сут
^-1449 Арктика, Колымская низменность, скважина 2/89 Многолетнемерзлый грунт, глубина 47.5 м, возраст 1800-3000 тыс. лет 0 »
^-1451 Арктика, Колымская низменность, скважина 3/89 Многолетнемерзлый грунт, глубина 6.7-7.0 м, возраст 5-10 тыс. лет 0 »
^-1452 Арктика, Колымская низменность, скважи
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.