ОНТОГЕНЕЗ, 2012, том 43, № 5, с. 350-356
= ГАМЕТОГЕНЕЗ
УДК 591.3:612.617.1:611.631.3:577.175.624:599.323.41
ОСОБЕННОСТИ РОСТА И РАЗВИТИЯ СЕМЕННИКОВ В ПОСТПУБЕРТАТНОМ ПЕРИОДЕ У МЫШЕЙ ИНБРЕДНЫХ
ЛИНИЙ PT И CBA/Lac
© 2012 г. Н. В. Гуторова, М. А. Клещёв, Л. В. Осадчук
Институт цитологии и генетики СО РАН 630090 Новосибирск, проспект Академика Лаврентьева, д. 10 E-mail: losadch@bionet.nsc.ru Поступила в редакцию 27.07.11 г.
Окончательный вариант получен 26.01.12 г.
Цель настоящего исследования состояла в сравнительно-генетическом анализе развития семенников в постпубертатный период (с 70 по 90 день жизни) у самцов мышей инбредных линий PT и CBA/Lac. Анализировали межлинейные различия по массе тела, семенников, уровню тестостерона в сыворотке периферической крови, количеству эпидидимальных сперматозоидов, площади семенного эпителия, просвета семенного канальца и островков клеток Лейдига. Обнаружено, что морфологические и гистоморфометрические параметры семенников у самцов линии PT, в отличие от CBA/Lac, не достигали дефинитивного уровня с окончанием пубертатного периода, а продолжали увеличиваться до 90 дня жизни. Таким образом, у лабораторных мышей генетические различия в те-стикулярном развитии продолжают формироваться в постпубертатный период.
Ключевые слова: онтогенез, морфометрия семенного канальца, клетки Лейдига, тестостерон, сперматозоиды, инбредные линии мышей.
Семенник млекопитающих является сложным органом, состоящим из семенных канальцев и интерстициальной ткани, которые соответственно продуцируют сперматозоиды и гормоны (Nel-Themaat et al., 2010). В семеннике можно выделить три важнейших типа клеток: половые клетки на разных стадиях развития, клетки Сертоли и Лейдига. Клетки Сертоли играют существенную роль в детерминации мужского пола и в поддержании сперматогенеза во взрослой жизни. Их пролиферация и дифференциация продолжается до начала половой зрелости, когда они прекращают делиться и начинают "выращивать" половые клетки (Petersen, Söder, 2006). Постнатальная дифференциация клеток Лейдига начинается у мышей приблизительно на 10-й день жизни. Формирование дефинитивной ("взрослой") популяции клеток Лейдига включает несколько стадий: развитие клеток-предшественников (14—28 день жизни), формирование незрелых (28—56 день жизни) и "взрослых" клеток Лейдига (56 день жизни и далее) (Mendis-Handagama, Ariyaratne, 2001). Это отражается в изменении продукции тестостерона семенниками, а на гистологическом уровне может сопровождаться характерными изменениями мор-фометрических параметров.
В наших предыдущих исследованиях были обнаружены достоверные межлинейные различия по сперматогенной функции у взрослых самцов
мышей инбредных линий (Осадчук, 2010). При этом наиболее контрастными по гормональному потенциалу семенников оказались линии РТ и СБЛ/Ьае (Дубовенко, Осадчук, 2010). Цель настоящей работы — установить межлинейные различия в стероидогенной и сперматогенной активности семенников в процессе постпубертатного развития у самцов мышей инбредных линий РТ и СБЛ/Ьае, используя классический гистологический подход и традиционные физиологические методы оценки функциональной активности. В задачи исследования входило: провести морфо-метрический анализ гистологических препаратов поперечных срезов семенников; измерить уровень тестостерона в сыворотке крови; определить количество эпидидимальных сперматозоидов у самцов мышей в постпубертатный период онтогенеза; выявить межлинейные различия в гисто-морфометрических, гормональных и спермато-генных параметрах.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
Условия эксперимента. Для исследования были взяты самцы (п = 64) двух инбредных линий РТ и СБЛ/Ьае в возрасте 70, 80 и 90 дней, не имевшие сексуального опыта. Репродуктивные клетки формировали из трех самок и одного самца в возрасте 60 дней. Самок на последней неделе бере-
менности отсаживали в отдельные клетки, день родов считали первым днем жизни их потомства. Через неделю после родов число детенышей в помете корректировали до 4—7. Мышей выращивали в стандартных условиях вивария Института цитологии и генетики СО РАН при фиксированном световом режиме 12 ч/12 ч (день-ночь, соответственно) и температуре +22°С, воду и корм животные получали без ограничений. Молодняк отсаживали от матерей в возрасте 30 дней. Группы самцов одного возраста и одной и той же линии формировали из нескольких пометов, размер групп составлял 4—6 животных. Для снятия эффекта группового содержания, животных за 4 дня перед декапитацией отсаживали в индивидуальные клетки (изоляция). Перед отсадкой на изоляцию и декапитацией животных взвешивали. Из эксперимента самцов мышей выводили с соблюдением правил гуманного обращения с животными. Самцов декапитировали, собирали кровь, семенники извлекали и взвешивали. Сперматозоиды выделяли из каудальных эпидидимисов, помещали в раствор фосфатного буфера и окрашивали эозином согласно описанной ранее методике (Осадчук, 2010). Подсчет сперматозоидов производили в камере Горяева при увеличении х200.
Гистоморфометрический анализ поперечных срезов семенников. Один семенник, полученный от каждого самца, помещали в раствор Буэна для фиксации (17—18 часов при комнатной температуре под вытяжкой), после чего переносили в пробирку с 70% спиртом, где хранили при +4°С для последующего гистологического анализа. Исследуемый материал обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в парафин. На санном микротоме изготавливали серийные срезы толщиной 5— 10 мкм и монтировали на предметные стекла смесью белка и глицерина в пропорции 1 : 1. Для получения обзорных препаратов срезы окрашивали гематоксилином Бемера и эозином. Препараты исследовали под световым микроскопом при увеличении х200.
Морфометрическое исследование гистологических препаратов поперечных срезов семенников проводили с использованием программного обеспечения Motic Image Inc. Измеряли общую площадь семенного канальца, площадь просвета семенного канальца, площадь островков клеток Лейдига, площадь сосудов и каверн в канальцах и островках клеток Лейдига. Площадь семенного эпителия рассчитывали как разницу площадей семенного канальца и его просвета, а суммарную площадь островков клеток Лейдига — как разницу суммарной площади островков клеток Лейдига и суммарной площади их сосудов.
Определение уровня тестостерона в сыворотке крови. Кровь центрифугировали 20 минут при 6000 об/мин и 4°С, свежую сыворотку отбирали в 1.5 мл пробирки типа Эппендорф, замораживали и хранили при —20°С до определения в ней тестостерона. Тестостерон в сыворотке крови определяли иммуноферментным методом с использованием набора "Стероид ИФА-тестостерон-01" (Алкор Био, Санкт-Петербург).
Статистический анализ данных. Статистическую обработку данных проводили двухфактор-ным дисперсионным анализом (главные факторы — генотип и возраст) с использованием пакета программ "STATISTICA 8.0". Различия между выборочными средними оценивали с использованием теста Duncan в рамках двухфакторного дисперсионного анализа.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Морфометрия поперечных срезов семенников.
Результаты двухфакторного дисперсионного анализа площади семенного эпителия (главные факторы — генотип и возраст животных) позволили установить достоверное влияние генотипа (F1 66 = = 25.32,p < 0.001), возраста (F266 = 3.88,p < 0.05) и достоверное взаимодействие факторов (F266 = = 6.57, p < 0.01). Площадь семенного эпителия у мышей инбредной линии PT на 70 и 80 день жизни была достоверно меньше, чем у 90-дневных животных (p < 0.05, рис. 1). На 70 и 80 день жизни площадь семенного эпителия у мышей линии CBA/Lac была достоверно больше, чем у PT (p <
< 0.05), а на 90 день жизни межлинейных различий не обнаружено (рис. 1). Таким образом, у самцов линии CBA/Lac возрастные изменения с 70 по 90 день жизни по этому признаку отсутствуют, в то время как у самцов линии РТ наблюдается увеличение площади семенного эпителия в период между 70 и 90 днем постнатального онтогенеза.
Двухфакторный дисперсионный анализ площади просвета семенного канальца обнаружил достоверное влияние возраста (F266 = 4.79, p <
< 0.05) и достоверное взаимодействие факторов (F2,66 = 4.04,p < 0.05). Площадь просвета семенного канальца достоверно не отличалась у мышей линии PT и CBA/Lac с 70 по 90 день постнатального онтогенеза (рис. 2). При этом значение параметра на 70 день у самцов линии PT было достоверно меньше, чем у 90-дневных (p < 0.05), в то время как у самцов линии CBA/Lac возрастных различий не наблюдалось. Таким образом, к 70 дню постпубертатного периода у самцов линии CBA/Lac развитие этого признака завершилось.
В изученный период онтогенеза обнаружено достоверное влияние генотипа (F166 = 29.67, p <
< 0.001) на величину суммарной площади островков клеток Лейдига и достоверное взаимодей-
Возраст, суток
Рис. 1. Площадь семенного эпителия (по оси ординат, мкм2) у самцов мышей инбредных линий PT и CBA/Lac в постпубертатном периоде (по оси абсцисс, сут). Здесь и далее достоверность межлинейных различий у самцов одного возраста: * PT и CBA/Lac.
ствие факторов (F266 = 4.60, p < 0.05). Значение этого признака было достоверно выше у самцов линии PT по сравнению с CBA/Lac на 70 и 80 дни жизни (p < 0.01, таблица). Достоверных возрастных изменений суммарной площади островков клеток Лейдига у самцов линии CBA/Lac не обнаружено, а у самцов линии PT по этому признаку наблюдались достоверные различия между 70 и 80, а также 80 и 90 днями (p < 0.01, таблица).
Масса семенников и масса тела. Двухфактор-ный дисперсионный анализ массы семенников обнаружил достоверное влияние генотипа (F156 = = 41.20,p < 0.001), возраста (F2 56 = 4.60,p < 0.05) и взаимодействие факторов (F256 = 4.07, p < 0.05). Самцы линии PT на 80 и 90 день жизни имели бо-
лее высокую массу семенников, чем СБЛ/Ьае (р <
< 0.01, рис. 3). Масса семенников у самцов линии РТ увеличивалась между 70 и 80, 80 и 90 днями жизни (р < 0.05). В то же время достоверных возрастных различий по массе семенников у самцов линии СБЛ/Ьае не наблюдалось.
Обнаружено достоверное влияние возраста (^2,54 = 31.23, р < 0.00
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.