МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 1, с. 26-31
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 576.8.095
ОСОБЕННОСТИ РОСТА НА РАПСОВОМ МАСЛЕ И СИНТЕЗА ЛИМОННОЙ И ИЗОЛИМОННОЙ КИСЛОТ У ДРОЖЖЕЙ
УАЯЯО№^1А Ь1РОЬУТ1СА
© 2007 г. С. В. Камзолова, Т. В. Финогенова, Ю. Н. Лунина, О. А. Перевозникова,
Л. Н. Миначова, И. Г. Моргунов1
Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино
Поступила в редакцию 06.03.2006 г.
При культивировании природного штамма Yarrowia Нро1уйса ВКМ У-2373 на полноценной среде показано, что для максимальной активности липазы концентрация рапсового масла в среде должна быть не менее 5.0 г/л; содержание глицерина и соотношение основных свободных жирных кислот, образованных в результате гидролиза масла, остаются постоянными в ходе роста, жирно-кислотный состав масла не претерпевает существенной модификации. В условиях лимитирования роста азотом при рН 6.0 происходит накопление лимонных кислот на уровне 77.1 г/л с преимущественным образованием изолимонной кислоты, в то время как при рН 4.5 накапливаются примерно равные количества лимонной и изолимонной кислот. Для мутанта Y. Нро^ка N 1 показано, что при рН 4.5 происходит преимущественное накопление лимонной кислоты (66.6 г/л) с незначительным количеством изолимонной кислоты. В период синтеза кислот дрожжи характеризуются высокой продукцией липазы.
Ключевые слова: Yarrowia lipolytica, лимонная кислота, изолимонная кислота, растительные масла.
В последние годы существенно возрос интерес к жирам растительного и животного происхождения, так как природные жиры являются продуктами постоянно возобновляемых сырьевых источников, которые могут быть получены практически в любой стране с разными биоресурсами.
Растительные масла, в том числе рапсовое масло, являются прекрасным сырьем для осуществления биотехнологических процессов. Однако сведения относительно роста дрожжей и других микроорганизмов на растительных маслах и получения ценных продуктов единичны и касаются получения микробных липидов [1-3] и липаз [2, 4].
Первым этапом утилизации растительных масел является их гидролиз внеклеточными липазами с образованием глицерина и жирных кислот. Сравнительно недавно было показано, что липазы способны осуществлять также обратную реакцию синтеза ацилглицеридов, что позволяет использовать липазы для получения стереоспецифичных глицеридов, обладающих заданными свойствами [2]. В настоящее время возрастает интерес к изучению и практическому получению липаз. Механизмы индукции и регуляции активности липаз до конца не выяснены. Серьезные исследования липаз микроорганизмов осуществлены в Институте
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: morgunovs@rambler.ru).
микробиологии РАН (Е.Л. Рубан, И.С. Звягинцева) и в ИБФМ РАН в лаборатории И.С. Кулаева.
Дрожжи вида Yarrowia (Candida) lipolytica являются удачным объектом для изучения особенностей роста на растительных маслах и синтеза ценных продуктов. Это определяется одновременно двумя моментами: 1) по своему таксономическому положению они обладают значительной активностью экзолипазы [5] и 2) склонны к биосинтезу органических кислот, особенно в случае использования в качестве источника углерода гидрофобных алифатических соединений - н-алканов [6] и жирных кислот [7].
В предшествующей работе [8] показано, что все штаммы дрожжей Y. lipolytica, имевшиеся в коллекции лаборатории аэробного метаболизма ИБФМ РАН хорошо растут в среде, содержащей рапсовое масло в качестве единственного источника углерода. При этом штаммы различаются по активности экзолипазы. Большинство штаммов склонны в условиях лимитирования роста источником азота экскретировать в среду значительные количества лимонных кислот. Для последующей работы нами были отобраны штаммы, отличающиеся повышенной активностью липазы и способные активно продуцировать лимонную (ЛК) и изо-лимонную (ИЛК) кислоты.
Целью настоящего исследования явилось изучение параметров роста и биосинтеза ЛК и ИЛК у
природного штамма Y. lipolytica ВКМ Y-2373 и его мутанта Y. lipolytica N 1 в среде с рапсовым маслом.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали два штамма дрожжей: природный штамм дрожжей Yarrowia lipolytica ВКМ Y-2373 (704) и его мутант N 1 (187/1). Штаммы характеризовались высокой активностью липазы и способностью к сверхсинтезу ЛК и ИЛК. В коллекции лаборатории штаммы поддерживали при 4°С на агаризованной среде Ридер с парафином (1%), пересевы проводили один раз в 3 месяца. Мутант N 1 получен путем обработки природного штамма нитрозометилмочевиной и селекционирован как продуцент ЛК из н-алканов [9].
Содержание жирных кислот в рапсовом масле составляет (в % от суммы кислот) C160 - 4.0; C180 -1.2; Cx8:x - 58.8; C^ - 28.1; C^ - 5.9.'
Культивирование дрожжей проводили в ферментере АНКУМ-2М объемом 3 л (исходный объем среды 1.5 л) и объемом 10 л (исходный объем 6.0 л). Автоматически поддерживали температуру (28.0 ± 0.1°C) и pO2 (55-60% от насыщения), pH среды (введением 20%-ного раствора NaOH) на уровне, указанном в тексте. Среда имела следующий состав (г/л): рапсовое масло (концентрация масла указана в тексте); (NH4)2SO4 - 3.0; KH2PO4 - 2.0; K2HPO4 - 0.2; MgSO4 ■ 7H2O - 1.4; Ca(NO3)2 - 0.4; NaCl - 0.5; микроэлементы по Буркгольдеру [10], тиамин - 0.5 мг/л. Время культивирования указано в тексте.
Методы определения биомассы, содержания масла, жирно-кислотного состава экстраклеточных липидов, количество азота и глицерина подробно описаны ранее [8]. Для определения содержания ЛК и ИЛК был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (HPLC). Элюцию вели при следующих условиях: скорость потока 1 мл/мин; температура 35°С, в качестве буфера использовали 20 мМ фосфорную кислоту. Для разделения ЛК и ИЛК применяли колонку с обращенной фазой Inertsil ODS-3 (250 х 4мм) ("Элсико", Россия). В работе использовали хроматограф фирмы LBK. Регистрацию кислот проводили при длине волны 210 нм. Органические кислоты идентифицировали в соответствии со стандартным раствором ЛК ("Boehringer Manheim", Германия).
Методы расчета удельной скорости роста дрожжей (ц), удельной скорости синтеза ИЛК + + ЛК (qp), выхода кислот по массе Yp и энергетического выхода продукта (np) подробно описаны ранее [8]. Для расчета этих параметров использовали общее количество кислоты с учетом фактора разведения.
Для количественного определения липазы в процессе культивирования дрожжей нами разработан титрометрический метод, описанный ранее
[8]. Количество фермента, катализирующего образование 1 мкмоль жирных кислот за 1 мин при 37°С, было принято за единицу активности липазы (Ед). Удельную активность липазы выражали в единицах активности в 1 мл культуральной жидкости (Ед/мл).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Рост природного штамма Y. ¡¡ро^ка ВКМ Y-2373 на полноценной среде с рапсовым маслом и продукция липазы
Природный штамм Y. Нро1уНса ВКМ У-2373 выращивали на полноценной среде (рапсовое масло - 20.0 г/л, ^Н4)^04 - 3.0 г/л) в ферментере объемом 3.0 л, автоматически поддерживали рН среды 5.0 ± 0.1. Типичная кривая роста Y. ¡¡ро1уНса представлена на рис. 1. Как видно из рис. 1а, сразу после засева в первые часы роста отмечалось резкое увеличение активности липазы, образование липазы происходило одновременно с ростом культуры в течение первых 10 ч по мере потребления рапсового масла. На 15 ч культивирования при снижении концентрации рапсового масла в среде культивирования ниже 5.0 г/л наблюдалось резкое снижение активности липазы, в то время как остаточный азот поддерживался на высоком уровне (данные не представлены). Следует отметить, что дополнительное внесение в среду масла (3.8 г/л) восстанавливало активность липазы и далее она возрастала до 47.0 Ед/мл на 18 ч роста. Это значение сравнимо с величинами, представленными для природных штаммов Y. ¡¡ро1уйса [11], но значительно ниже величин для специально полученных генетически модифицированных мутант-ных штаммов Y. ¡¡ро1уйса [2, 4]. Следовательно, при культивировании Y. ¡ipo¡ytica на средах, содержащих рапсовое масло, необходимо обеспечение клеток достаточным количеством масла (не ниже 5.0 г/л) для поддержания высокой продукции липазы. В последующих экспериментах поддерживали уровень остаточного масла не ниже 5.0 г/л.
На основании данных, полученных на прямолинейном отрезке кривой роста, была рассчитана максимальная удельная скорость роста (Цтах), равная 0.281 ч-1, которая сравнима со значениями, полученными другими авторами для Y. ¡¡ро^ка, растущих на жирных кислотах [1-3]. Выход по биомассе от потребленного масла ^х/8) составлял 0.638, что ниже величин, представленных в литературе для разных штаммов Y. ¡¡ро^ка, растущих на жирных кислотах (0.9 ± 0.2 г/г) [1-3]. Вероятно, это можно объяснить низким уровнем азота, недостаточным для активного функционирования белоксинтезирующих систем.
В ходе культивирования измеряли уровень глицерина и свободных жирных кислот. Как видно из рис. 16, содержание глицерина практически
28
КАМЗОЛОВА и др.
Биомасса, масло, г/л 20
15
Активность липазы, Ед/мл
45
10
5
30
15
0
Жирные кислоты, %
60
45
30
15
0
Глицерин, г/л 0.20
'-♦- -♦—" 5
(б) -
6 -
х>-- <г 1 ~~ --- - -о' 1 1 1 - -о----•> 1
0.15
0.10
0.05
3 6 9 12 15 Время, ч
18
Рис. 1. Кинетика роста природного штамма У. Иро1у-tica ВКМ У-2373, потребления масла, активность липазы (а), содержание глицерина и жирных кислот (б) при рН среды 5.0 на полноценной среде: 1 - биомасса, 2 - масло, 3 - липаза, 4 - глицерин, 5 - С18:1, 6 - С стрелкой обозначено время добавления масла.
18:2'
не изменялось и поддерживалось на уровне 0.0350.056 г/л. Качественный анализ липидных фракций не обнаружил существенных изменений в уровне свободных жирных кислот в ходе культивирования (данные не представлены). Так как в ходе культивирования не накапливается ни один из продуктов гидролиза масла, можно было предположить, что потребление глицерина и жирных кислот дрожжами Y. lipolytica происходит одновременно. Преобладающими жирными кислотами являлись олеиновая (C18:1) (58.8-61.3%) и линолевая (C18:2) (26.6-28.1%) кислоты, и существенных изменений в состав
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.