ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2007, том 54, № 4, с. 511-516
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
УДК 581.1
особенности со2-газообмена h структурной организации хлоропластов растений картофеля, трансформированных геном дрожжевой инвертазы,
в условиях гипотермии
© 2007 г. А. Н. Дерябин, М. С. Синькевич, С. В. Климов, Н. В. Астахова, Т. И. Трунова
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 21.09.2006 г.
Провели сравнительное изучение особенностей роста, С02-газообмена и ультраструктуры хлоропластов листьев у растений картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Дезире) дикого типа и трансформированного геном дрожжевой инвертазы, находящимся под контролем клубнеспецифичного промотора пататина B33 класса I (апопластный вариант локализации фермента), выращенных in vitro на МС-среде с 2% сахарозы. При оптимальной для роста температуре 22°C трансформант отличался от растений дикого типа (контроль) заторможенным ростом и пониженной скоростью фотосинтеза при расчете на растение. При расчете на сухую массу листьев фотосинтез трансформанта, напротив, оказался более высоким, чем в контроле. При гипотермии (5°C) темновое дыхание и, особенно, фотосинтез у трансформантов оказались более интенсивными, чем в контроле. После длительной холодовой экспозиции (6 суток при 5°C) у растений обоих генотипов ультраструктура хлоропластов изменялась: увеличивались абсолютные площади срезов хлоропласта и крахмальных зерен, уменьшалась площадь пластоглобул; причем у трансформантов - в более выраженной форме. По ряду ультраструктурных показателей: уменьшению на холоде относительной суммарной площади среза крахмальных зерен и пластоглобул (в процентах от площади среза хлоропласта) и численности гранных тилакоидов (в расчете на площадь среза хлоропласта), трансформанты обнаруживали признаки более холодостойкого растения, чем контрольные растения дикого типа. Полученные результаты обсуждаются с позиций изменения у трансформантов картофеля донорно-ак-цепторных отношений, в результате которых модифицированный баланс между фотосинтезом и заторможенным оттоком ассимилятов проявляется в виде повышения внутриклеточного содержания сахаров и устойчивости к гипотермии.
Solanum tuberosum - ген дрожжевой инвертазы - промотор пататина B33 - донорно-акцепторные отношения - фотосинтез - дыхание - ультраструктура хлоропласта - рост - холодовой стресс
ВВЕДЕНИЕ
Холодостойкость растений в значительной степени зависит от углеводного метаболизма и донорно-акцепторных отношений (ДАО), определяющих уровень сахаров, накапливаемых в клетках различных органов. Полифункциональная роль сахаров в устойчивости к низким температурам, наиболее полно изученная у группы морозостойких растений, связана, прежде всего, с их криопротекторным действием на мембранную систему клетки, а также участием в метаболических процессах в качестве источника энергии и
Сокращения: ДАО - донорно-акцепторные отношения; п - ген дрожжевой инвертазы.
Адрес для корреспонденции: Дерябин Александр Николаевич. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 007 (495) 977-80-18; электронная почта: trunova@ippras.ru
предшественников других веществ, обладающих защитным эффектом. Есть данные о модифицирующем влиянии сахаров на плазмалемму, способствующем ее гомеовязкостной адаптации при гипотермии [1]. Показано, что накопление сахаров и их распределение в листьях и узлах кущения озимых злаков при холодовой адаптации обусловлено кардинальными изменениями в их транспорте и характере СО2-обмена: дыхание ин-гибировалось низкими закаливающими температурами в большей степени, чем фотосинтез [2]. Сохранение высокой скорости фотосинтеза при низких положительных температурах является важным фактором холодового закаливания и последующего выживания растений при перезимовке [3]. У чувствительных к холоду видов растений именно фотосинтез подавляется в первую очередь. Это подавление имеет поначалу обратимый характер и становится необратимым при более длительных экспозициях [4]. Так, для огурца, вы-
ращенного при температуре 22°C, длительная экспозиция при 10°C (5 суток) на свету оказала необратимое ингибирующее действие на фотосинтез, тогда как для более холодостойкого томата угнетение фотосинтеза при той же экспозиции было обратимо.
Вопрос о роли углеводного обмена и ДАО в формировании устойчивости холодостойких (не морозостойких) растений изучен в значительно меньшей степени. Для его исследования весьма целесообразным может быть использование типичного представителя холодостойких растений -картофеля. Растение картофеля, экспрессирую-щее ген дрожжевой инвертазы (inv), находящийся под контролем клубнеспецифичного промотора пататина B33 класса I (апопластная локализация фермента), представляет собой организм с измененными ДАО [5]. Акцепторная способность у них снижена из-за повышения активности кислой нерастворимой инвертазы, расщепляющей транспортную форму сахаров - сахарозу, на простые сахара (глюкозу и фруктозу), что приводит к ин-гибированию оттока ассимилятов из фотосинтези-рующих тканей и к накоплению их в листьях [6, 7]. Эти трансформанты имеют сниженный порог концентрации сахарозы (1-2%), необходимой для инициации клубнеобразования [8] и более высокую устойчивость к окислительному стрессу, вызванному гипотермией [7, 9]. Учитывая, что устойчивость растений к гипотермии сопряжена с холодостойкостью фотосинтетического аппарата [10, с. 28], важно было изучить влияние экспрессии чужеродного гена в растениях картофеля, повлекшего за собой изменения ДАО, на структуру хлоропластов, а также на скорость фотосинтеза и темнового дыхания.
Известно, что длительное микроклонирование растений картофеля in vitro ускоряет автоселекционные процессы, направленные на отбор растений с лучшими ростовыми свойствами при заданных условиях, в частности, при гетеротрофном питании. Отбор по гетеротрофному признаку приводит в итоге к снижению фотосинтетической активности этих растений [11]. Проведенные авторами измерения показали, что количество углекислоты, поступающей диффузно из воздуха через ватно-марлевую пробку, способно обеспечить лишь 5-6% фотосинтетических потребностей пробирочного растения и, благодаря богатым органикой питательным средам, рост их происходит в основном гетеротрофно. Это свидетельствует о резком лимитировании процесса фотосинтеза растений картофеля в условиях in vitro недостатком углекислого газа. При этом, судя по содержанию пигментов и уровню светового насыщения фотосинтеза, растения обладали нормально сформированным фотосинтетическим аппаратом. Но учитывая низкий уровень газообмена между внешней средой и средой в пробирке,
фотосинтетическая функция растений заключается, по мнению авторов, в поглощении С02, выделяющегося при гетеротрофном росте, а выделяемый растениями кислород способствует гетеротрофному росту [12]. В работе Балагуровой с соавт. [13] показано, что в палисадных клетках листьев картофеля, испытывающих действие низких температур (5°C в течение 10 суток и далее ступенчатое снижение температуры от 0 до -2°C), были обнаружены следующие ультраструктурные изменения: увеличение плотности содержимого клеток; увеличение мембранной поверхности в клетках, выражающееся в возрастании числа элементов эндоплазматического ретикулу-ма и крист митохондрий; появление множества инвагинаций тонопласта, заполненных мембранными образованиями; приобретение тилакоида-ми извилистости, исчезновение из хлоропластов крахмальных зерен. При этом авторы обнаружили повышенную устойчивость листьев картофеля к гипотермии по сравнению с растениями, не подвергавшимися охлаждению.
В связи с вышеизложенным, цель данной работы заключалась в выяснении возможной связи более высокой холодостойкости трансформированных растений картофеля со структурой и функцией фотосинтетического аппарата и, в частности, с ультраструктурой хлоропластов и со скоростями фотосинтеза и темнового дыхания. С этой целью трансформированные растения, выращенные in vitro, изучали при нормальной для роста температуре и после действия гипотермии.
МЕТОДИКА
Объектом исследования служили растения картофеля (Solanum tuberosum L., сорт Дезире), экспрессирующие ген дрожжевой инвертазы (inv), находящийся под контролем клубнеспецифичного промотора пататина В33 класса I и содержащий последовательность лидерного пептида ингибитора протеиназы II для апопластной локализации фермента (B33-inv растения). Трансформанты также содержали маркерный ген устойчивости к канамицину nptII. Контролем служили нетрансформированные растения картофеля этого же сорта (дикий тип). Растения были отобраны из коллекции клонов, полученных в результате совместной работы сотрудников Института молекулярной физиологии растений им. Макса Планка (Гольм, Германия) и Лаборатории роста и развития им. М.Х. Чайлахяна ИФР РАН.
Растения размножали микрочеренкованием in vitro и выращивали в камере фитотрона ИФР РАН при 22°C и 16-часовом освещении люминесцентными лампами белого света (освещенность 4 клк) в течение 5 нед. в пробирочной культуре на агаризованной МС-среде, содержащей 2% сахарозы и витамины (мг/л): тиамин - 0.5, пиридоксин
ОСОБЕННОСТИ С02-ГА300БМЕНА и СТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ 513
Таблица 1. Скорость роста и СО2-газообмен контрольных растений картофеля дикого типа (К) и ВЪЪ-ту растений в норме (22°С) и при холодовой экспозиции (5°С)
Показатель 22°C 5°C 5°/22°C
К B33-i«v К B33-i«v К B33-i«v
Относительная скорость роста:
мм/(см сутки) 0.23 0.19 - - - -
мг/(г сутки) 43 20 - - - -
Истинный фотосинтез, мг СО2/(г сухой массы листьев ч) 7.2 ± 0.6* 10.9 ± 0.8* 0 1.5 ± 0.9 0 14
Темновое дыхание, мг СО2/(г сухой массы листьев ч) 0.80 ± 0.03 1.40 ± 0.25 0.20 ± 0.02 0.50 ± 0.06 30 36
Истинный фотосинтез (Ф), мг СО2/(растение ч) 868 ± 79* 576 ± 45* 0 79 ± 46 0 14
Темновое дыхание (Д), мг СО2/(растение ч) 300 ± 13 284 ± 50 79 ± 9 99 ± 11 26 35
Отношение Ф/Д 2.9 2.0 0 0.8 0 40
* Различия между контрольными и В33-п растениями достоверны при 95%-ном уровне значимости.
- 0.5, мезоинозит - 60. Холодовому воздействию растен
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.