МИКРОБИОЛОГИЯ, 2007, том 76, № 5, с. 652-661
= ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ СТАТЬИ =
УДК 631.46:579.8.1017.6+0863]
ОСОБЕННОСТИ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ И ЦИКЛА РАЗВИТИЯ ПОЧВЕННЫХ УЛЬТРАМИКРОБАКТЕРИЙ, ОТНОСЯЩИХСЯ К КЛАССУ ЛЬРИЛРЯОТЕОВЛСТЕШЛ
© 2007 г. В. И. Дуда***, Н. Е. Сузина*, В. И. Акимов*, М. Б. Вайнштейн***, В. В. Дмитриев*1, Е. С. Баринова**2, Т. Н. Абашина**, Р. Р. Олейников*, Т. 3. Есикова*, А. М. Боронин***
*Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, Пущино **Пущинский государственный университет Поступила в редакцию 26.12.2006 г.
Выделены грамотрицательные хемоорганотрофные почвенные ультрамикробактерии (УМБ) -штаммы №1 и №3, образующие в цикле развития мелкие кокковидные клетки с размерами 400-800 нм и ультрамелкие - 200-300 нм. Филогенетически штаммы №1 и №3 относятся к а-протеобактериям и близки к типовому штамму недавно описанного вида - Каг^Иа а&рМа. Ультраструктура клеток УМБ изучена с помощью ультратонких срезов и криофрактографии. Установлено, что клеточная стенка УМБ относится к грамотрицательному типу строения: в ее структуре хорошо различаются наружная мембрана и пептидогликановый слой. Поверхность клеток обладает многочисленными выступами (простеками) конической, либо сферической формы, заполненными содержимым периплазмы. Для УМБ характерно образование необычных клеточных структур (не встречающихся у известных свободноживущих бактерий): а) стопок палочковидных субъединиц диаметром ~30 А и длиной 150-250 А, б) длинных пучков (до 300-400 А), состоящих из нитевидных субъединиц, и в) крупных электронноплотных шаровидной формы телец (до 200-300 А в диаметре), локализованных в периплазме. Характерным свойством УМБ является их способность к факультативному паразитизму на живых клетках цианобактерий (Ц); при этом проявляется 3 типа взаимодействия УМБ и Ц: 1) адсорбция клеток УМБ на поверхности клеток Ц, 2) внедрение УМБ вглубь полисахаридных чехлов и 3) проникновение УМБ внутрь цитоплазмы Ц. Установлено, что клетки УМБ размножаются путем почкования, при этом почки (до 2-3) располагаются непосредственно на материнской клетке, а промежуточные гифы не образуются.
Ключевые слова: ультрамикробактерии, ультраструктура клеток, паразитизм, межклеточные контакты, электронная и флуоресцентная микроскопия, бинарные культуры бактерий.
Изучению ультрамикробактерий (УМБ), обитающих в морях и внутриконтинентальных водоемах, посвящены работы многих исследователей [1-4], и лишь единичные работы касаются изоляции и характеристики почвенных УМБ [3, 5-7]. В них сообщается о получении изолятов почвенных УМБ, видовой статус которых еще требует уточнения.
Между тем, без изоляции и характеристики ге-но- и фенотипических свойств чистых культур невозможно оценить роль УМБ в биосфере, их ультраструктурное, метаболическое разнообразие и вероятность осуществления ими еще неизвестных биохимических процессов. При изучении микроорганизмов in situ в нефтешламах с помощью трансмиссионной электронной микроскопии и метода получения ультратонких срезов микромо-
1 Адресат для корреспонденции (e-mail: dmitriev@ibpm.push-chino.ru)
2 В настоящее время работает в Институте микробиологии им. С.Н. Виноградского РАН, Москва.
нолитов почвы [8] мы обнаружили в образцах ила (нефтешлама) необычную ультрамелкую бактерию (нанобактерию), многие кокковидные клетки которой имели нанометровую размерность: их диаметр был равен 0.2-0.3 мкм, а у некоторых клеток - менее 0.2 мкм, и, таким образом, они не видны в обычном световом микроскопе.
Настоящее сообщение посвящено изоляции, характеристике цитологии и цикла развития ультрамикробактерии, сходной с нанобактерией, обнаруженной нами в нефтешламе in situ.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Субстраты для выделения бактерий. Использованы следующие субстраты: 1) нефтешлам (ил, обогащенный нефтепродуктами), пребывавший в полевых условиях более 35 лет (Нижнекамск, Татарстан, Россия) и содержащий до 40% органических веществ (из них ~30% нефтепродукты),
2) светло-каштановая почва, горизонт B1 (Прикаспийская низменность, Волгоградская область, Россия), 3) придонный ил озера Байкал, 4) лабораторная водная культура растения Pedilantus tithymaloides (сем. Euphorbiacea).
Среды и методы для выделения, характеристики физиологических свойств и таксономических признаков бактерий. Для первичного выделения и получения чистых культур бактерий были использованы: а) агаризованный нефтешлам (АН), в состав которого входили: 30 г сырого нефтешлама, 6 г агара и 300 мл водопроводной воды; б) агаризованная почва (АП): 30 г воздушно-сухой перегнойно-глеевой почвы (горизонт A1) (Приокско-Террасный заповедник) или светло-каштановой почвы (горизонт B1), 6 г агара и 300 мл воды (стерилизуемых при 1 атм в течение 1 ч) и в) триптонно-соевый агар (среда 5/5, изготавливающаяся в ИБФМ РАН) - для выделения бактерий из прикорневой зоны растения P. tithymaloides). Фенотипическую характеристику изо-лятов осуществляли, используя стандартные общепринятые методы [9].
Культуры цианобактерий. В исследованиях использованы коллекционные штаммы цианобактерий: Chlorogloeopsis fritschii ATCC 27193; Ana-baena variabilis ATCC 29413; Nostoc muscorum 11 и Spirulina sp. 287, а также Chlorogloeopsis sp. S, выделенный нами из нефтешлама и определенный до рода. Цианобактерии выращивали в жидкой и на агаризованной среде BG 11 [10] при температуре 28°С и непрерывном освещении люминесцентными лампами (1500 лк).
Выращивание кокультур. К жидким культурам цианобактерий, выращенным в течение 20 сут, добавляли равные объемы жидких пятису-точных культур штаммов NF1 и NF3, инкубированных в синтетической среде с глюкозой и содержавших ~3-3.8 х 1010 КОЕ/мл. Культивирование осуществляли при 20°С. Наблюдения вели в течение 30 сут.
Биохимические и молекулярно-биологиче-ские методы. Качественный состав цитохромов в клетках изолятов определяли по дифференциальным спектрам поглощения и по спектрам первой производной согласно [11] на спектрофотометре Shimadzu UV-160. Анализ на наличие в клетках плазмидной ДНК осуществляли, используя модифицированный метод Экхардта [12]. Мол. % Г+Ц в ДНК определяли методом термической денатурации [13].
Анализ нуклеотидной последовательности гена 16S pPHK. Гены 16S рРНК амплифицировали с помощью ПЦР и универсальных бактериальных праймеров 27F и 1492R [14], секвенировали с использованием Beckman-Coulter CEQ™ 2000XL DNA Analysis System. Для филогенетического
анализа в Treecon [15] использовали почти полную последовательность гена 16S рРНК [15].
Микроскопические методы. Морфологию и тонкую структуру клеток бактерий изучали применяя фазово-контрастную, эпифлуоресцентную и электронную микроскопию. Для эпифлуорес-центной микроскопии клетки в кокультурах штаммов NF1, NF3 и цианобактерий фиксировали 1.5% глутаральдегидом в течение 30 мин и окрашивали 1 мкг/мл, ДАФИ (4,6-диамидино-2-фени-линдол, DAPI) в течение 5 мин. Препараты просматривали в микроскопах Polyvar ("Reichert") и ЛЮМАМ (ЛОМО, Россия) при возбуждении флуоресценции УФ-светом с максимумом в области 3б0 нм. Окраска ДАФИ позволяла одновременно выывлять как клетки штаммов NF1 и NF3, так и цианобактерии, при этом цианобактерии были видны за счет их автофлуоресценции: их красная и оранжевая флуоресценция была обусловлена присутствием в клетках хлорофилла и фикобилинов, кроме того слабой зеленой флуоресценцией обладали чехлы.
Реплики криосколов клеток получали в вакуумной установке JEE-4X с помощью приспособлений, обеспечивающих охлаждение микробных клеток со скоростью ~106 град/с. Биомассу замораживали в жидком пропане, переохлажденном жидким азотом до температуры -196°С. Скол осуществляли при достижении вакуума 3 х 10-4 Па и температуре образца -100°С. Реплику с поверхности скола получали путем нанесения в вакууме платино-углеродной смеси под углом 30° и укрепляющего слоя чистого углерода под углом 90°.
Для приготовления ультратонких срезов использовали микромонолиты нефтешлама и биомассу клеток. Для получения микромонолитов из 10 кг образца слабо влажного нефтешлама, находившегося в стационарном состоянии в течение 3-6 месяцев стерильными скальпелем и ланцетом вырезали блок в виде кубика со стороной ~3-5 мм так, чтобы не нарушить естественное сложение материала. Микромонолиты и биомассу клеток чистых культур предфиксировали 1.5% (в./об.) раствором глутаральдегида в 0.05 М какодилат-ном буфере (рН 7.2) при 4°C в течение 1 ч. После трехкратной промывки этим же буфером материал дополнительно фиксировали 1% раствором OsO4 в 0.05 М какодилатном буфере при 20°С в течение 3 ч. Для контрастирования полисахаридов клеточных стенок, чехлов и вещества капсул применяли глутар-осмиевую фиксацию в присутствии рутениевого красного [16]. После дегидратации материал заключали в эпон 812 и делали ультратонкие срезы на ультратоме LKB III (Швеция). Срезы монтировали на медные сетки, покрытые формваровой пленкой и контрастировали 3% раствором уранилацетата в 70% этаноле в течение 30 мин, а затем окрашивали цитратом свинца [17] при 20°С в течение 4-5 мин при 20°С.
Рис. 1. Электронномикроскопические (а, б, г, д) и фазовоконтрастная (в) микрофотографии клеток штамма №1: а - ультратонкий срез агрегатов наноклеток в виде шаровидных структур (ШС), локализованных в виде микроколоний в образце нефтешлама; б - увеличенный фрагмент периферической части двух ШС. Показана тонкая структура компартментов ШС и отходящих от ШС сферических наноклеток; в - клетки штамма в фазово-контрастном микроскопе. Видны наноклетки в цепочках и гроздьях (4-недельная культура на АН); г, д - тонкая структура клеток штамма №1 из колоний на АН (2-суточная культура); на рис. 1г виден переход цитоплазмы в почку. Длина метки на рис. 1а, б, г, д - 300 нм, в - 10 мкм. Обозначения на рисунках 1-8. ВМ - везикулы наружной мембраны, Гр - гранулярное вещество в периплазме, НМ - наружная мембрана, К - капсулярный слой, Н - нуклеоид, П - периплазма, Пч - почка, ПН - пучки нитей, ТПС - тельца с периодической структурой, ПБ - гранулы поли-Р-гидроксибутирата, Пр - перетяжка, ПФ - гранулы полифосфатов, ЦК - центральная клетка,
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.