НЕЙРОХИМИЯ, 2012, том 29, № 2, с. 134-138
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
УДК 612.822+615.214.2
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕИСТВИЯ НЕИРОМЕДИАТОРНЫХ СИСТЕМ В НИГРОСТРИАТНЫХ ОБРАЗОВАНИЯХ МОЗГА КРЫС ПРИ ДЛИТЕЛЬНОМ ВВЕДЕНИИ РЕЗЕРПИНА И ГАЛОПЕРИДОЛА
© 2012 г. Д. Н. Воронков*, Е. Л. Доведова, Р. М. Худоерков
Научный центр неврологии РАМН, Москва
Спектрофотометрически исследовали удельную активность ферментов обмена дофамина (тирозин-гидроксилаза, моноаминоксидаза Б), ацетилхолина (ацетихолинэстераза), глутамата (глутаминсинте-таза) в хвостатом ядре и черной субстанции мозга крыс Вистар под влиянием длительного, в течение 14 дней, воздействия препаратов резерпина и галоперидола. Показано подавление синтеза и катаболизма дофамина и активация холинергической системы при подавлении активности ацетилхолинэс-теразы. Отмечены особенности изменений холинергической и глутаматергической систем, связанные с нарушением дофаминергического обмена под действием резерпина и галоперидола.
Ключевые слова: дофаминергическая система, моноаминоксидаза Б, тирозингидроксилаза, ацетилхо-линэстераза, глутаминсинтетаза, черная субстанция, хвостатое ядро, нигростриатная система, га-лоперидол, резерпин.
ВВЕДЕНИЕ
Дисфункции обмена дофамина отводится важная роль в развитии нейродегенеративных процессов, протекающих в нигростриатных образованиях мозга — черной субстанции и хвостатом ядре, и приводящих в частности к болезни Паркинсона [1]. При воспроизведении дисфункций обмена дофамина в зависимости от мишени воздействия ни-гростриатные образования реагируют по-разному, что связано с широким спектром физиологических эффектов дофамина, которые обусловлены как многообразием действия его рецепторных механизмов, так и путями регуляции активности до-фаминергической системы [2, 3]. Нарушения обмена дофамина сопровождаются значительными изменениями баланса нейромедиаторов, в том числе ацетилхолина и глутамата, которым придается важная роль в регуляции двигательной активности [1, 4, 5].
Существующие схемы функционирования до-фаминергических структур мозга не всегда согласуются с экспериментальными данными, что подчеркивает необходимость выяснения особенностей взаимодействия нейромедиаторных систем в этих образованиях [4]. Одним из подходов для анализа изменений метаболизма медиаторов в нигро-стриатной системе может быть использование препаратов, отличающихся механизмами воздействия на различные этапы дофаминергической передачи — резерпином (истощающим везикуляр-
* Адресат для корреспонденции: 105064, Москва, пер. Обуха, 5; тел.: 8-916-216-93-96, e-mail: voronkovdm@gmail.com.
ный пул медиатора) и галоперидолом (антагонистом Э2 рецепторов) [1, 6].
Цель настоящего исследования — оценка изменений активности ферментов, связанных с обменом дофамина, ацетилхолина и глутамата под влиянием длительного воздействия резерпина и галоперидола в нигростриатных образованиях мозга.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Эксперимент проводили на 30 крысах Вистар (самцы, масса тела 180—240 г), полученных из питомника РАМН, которых содержали в обычных условиях вивария при постоянном доступе к воде и пище. Животных делили на три равные группы. Одной группе на протяжении 14 дней ежедневно внутрибрюшинно вводили свежеприготовленный раствор галоперидола (0.5 мг/кг), другой — резерпин (1.5 мг/кг) в изотоническом растворе №С1, содержавшем 0.05% Твин-80 (0.5—1.0 мл). Интакт-ным животным — третьей, контрольной группе, внутрибрюшинно вводили растворитель. Все манипуляции с животными проводили согласно с "Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных".
Через 60 мин после последнего введения препаратов животных декапитировали под легким эфирным наркозом. На холоду извлекали мозг и выделяли хвостатое ядро и черную субстанцию. Готовили 10% гомогенат на среде выделения следующего состава: 0.01 М Трис-НС1 буфер (рН = = 7.4 при 0°С), 0.32 М сахароза, 0.001 М ЭДТА-Ш2. Методом дифференциального центрифугирова-
Таблица 1. Активность ферментов обмена дофамина в хвостатом ядре и черной субстанции при длительном введении резерпина и галоперидола
Хвостатое ядро Черная субстанция
ТирГд МАО Б ТирГд МАО Б
M ± s % M ± s % M ± s % M ± s %
Контроль Резерпин Галоперидол 1.45 ± 0.3 0.89 ± 0.3* 1.07 ± 0.1* 100 -39 -26 1.20 ± 0.2 0.84 ± 0.1* 1.20 ± 0.3 100 -30 0 1.57 ± 0.4 1.06 ± 0.2* 1.34 ± 0.4 100 -32 -15 1.70 ± 0.2# 1.33 ± 0.3* 1.18 ± 0.4* 100 -22 -31
Обозначения: ТирГд — удельная активность тирозингидроксилазы (AD335 х 60 мин/мг белка в пробе), MAO B — удельная активность моноаминоксидазы Б (AD450 х 60 мин/мг белка в пробе); M - среднее, s — среднеквадратичное отклонение; % — изменения в процентах от контроля; * — значимые отличия от контроляp < 0.05, ANOVA Post-Hoc Fisher LSD тест; # — значимые различия между структурами в контрольной группеp < 0.05, ANOVA Post-Hoc Fisher LSD тест.
ния [7], после удаления фракции ядер (центрифуга К-70 (Германия), 1000 g, 10 мин, t = -10°С) изолировали субклеточные фракции: фракцию 1 осаждали при 10000 g (20 мин, t = —10°С) и использовали ее для определения активности моноаминок-сидазы Б (МАО Б), часть надосадочной жидкости использовали для определения активности аце-тилхолинэстеразы (АХЭ) и глутаминсинтетазы (ГлнС). Фракцию 2 осаждали при 20000 g (Beckman L8-70 (США), t = 0°С, 15 мин) и использовали для определения активности тирозингидроксилазы (ТирГд). Ферментативную активность исследовали спектрофотометрически (спектрофотометры Gilford 250, LKB Ultrospec II).
Активность ТирГд определяли по окислению кофактора реакции гидроксилирования — 6-мети-лтетрагидроптерина и выражали в А0335/мг белка в пробе за 60 мин [8]. Состав реакционной смеси: 0.1 М Трис-малеиновый буфер (pH = 6.2 при 37°С); 2-меркаптоэтанол, 50 mM; FeSO4, 0.5 mM; 3-оксибензилгидразин, 0.1 mM; L-тирозин, 0.5 mM; 6-метилтетрагидроптерин, 0.5 mM; исследуемая фракция — 50 мкл. Прирост поглощения регистровали при 37°C на протяжении 10 мин с момента добавления 6-метилтетрагидроптерина. Активность МАО Б определяли, используя субстрат п-нитрофенилэтиламин, и выражали в А0450/мг белка в пробе за 60 мин [9]. Состав реакционной смеси: калий-фосфатный буфер 0.1 М (pH = 7.4 при 37°С); 1% (w/v) детергент 0П-10; п-нитрофенил-этиламин, 4 mM; исследуемая фракция 100 мкл. Реакционную смесь инкубировали 60 мин в термостате при 37°C, после чего спектрофотометрирова-ли. Активность АХЭ определяли по расщеплению ацетилхолина и выражали в мкМ ацетилхолина/мг белка в пробе [10]. Состав реакционной смеси: 0.6 M калий-фосфатный буфер, pH = 7.8, ацетилхолина хлорид, 100 мкг; щелочной гидроксил-амин, 20 mM; 25 мкл исследуемой фракции. После инкубации (60 мин, 37°C) реакцию останавливали, добавляя 2 мл 2% FeCl3 на 0.18 M НС1. После раз-
вития окраски пробу спектрофотометрировали при 540 нм.
Активность ГлнС определяли по образованию у-глутамилгидроксамата [11] и выражали в А^540/мг белка в пробе, за 30 мин, состав реакционной смеси: Трис-HCl буфер 0.01 М (pH =7.2 при 37°С); гидроксиламин, 100 mM; L-глутамин, 50 mM; MgCl2, 20 mM; 2-меркаптоэтанол, 25 mM; АТФ, 10 mM; 50 мкл исследуемой фракции. После инкубации (30 мин, 37°C), реакцию останавливали добавлением раствора, содержащего FeCl3 0.37 M; 0.3 M трихлоруксусную кислоту и 0.6 M HCl, и спектрофотометрировали.
Содержание белка в пробе определяли по Ло-ури [12], калибровочную кривую строили, используя раствор БСА (Merck).
Статистическую обработку полученных данных производили в программе Statistica 6.0 методом дисперсионного анализа (ANOVA), о различиях между группами судили по апостериорным тестам (Fisher Post-Hoc LSD test).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Проведенное исследование показало, что при длительном введении галоперидола и резерпина у животных нарушалась двигательная активность и появлялась выраженная гипокинезия. Под влиянием резерпина также отмечали тремор и характерную позу, вызванную ригидностью мышц туловища, что неоднократно было описано в литературе [6].
Изменения в системе синтеза дофамина оценивали по удельной активности ключевого фермента — тирозингидроксилазы (ТирГд). У контрольных крыс отличий по удельной активности ТирГд между исследуемыми структурами — хвостатым ядром и черной субстанцией, не обнаружили (табл. 1). По сравнению с контролем удельная активность ТирГд под влиянием резерпина статистически значимо подавлялась как в хвостатом ядре (на 39%), так и в черной субстанции (на 32%). Под
136
ВОРОНКОВ и др.
Таблица 2. Активность ацетилхолинэстеразы и глутаминсинтетазы в хвостатом ядре и черной субстанции при длительном введении резерпина и галоперидола
Хвостатое ядро Черная субстанция
АХЭ ГлнС АХЭ ГлнС
M ± s % M ± s % M ± s % M ± s %
Контроль 21.23 ± 7.3 100 0.77 ± 0.1 100 19.79 ± 3.2 100 0.37 ± 0.1# 100
Резерпин 19.62 ± 7.1 -8 0.66 ± 0.1* -14 12.98 ± 3.6** -34 0.37 ± 0.1 0
Галоперидол 13.60 ± 6.4* -36 0.71 ± 0.1 -8 12.69 ± 6.8** -36 0.39 ± 0.1 +5
Обозначения: АХЭ — активность ацетилхолинестеразы (мкМ ацетилхолина/мг белка в пробе), ГлнС — удельная активность глутаминсинтетазы (АД540 х 30 мин/мг белка в пробе); M — среднее, s — среднеквадратичное отклонение; % — изменения в процентах от контроля; * — значимые различия от контроляp < 0.05; ** — p < 0.07; # — значимые отличия между структурами в контрольной группеp < 0.05, ANOVA Post-Hoc Fisher LSD тест.
действием галоперидола в хвостатом ядре она значимо снижалась (на 26%) и проявляла тенденцию к снижению (на 15%) в черной субстанции.
Полученные результаты указывают на снижение синтеза дофамина при длительном подавлении дофаминергической медиации используемыми препаратами. Литературные данные подтверждают торможение активности ТирГд при длительном введении нейролептиков [3, 13, 14]. В наших экспериментах галоперидол в большей степени снижал удельную активность ТирГд хвостатого ядра, чем черной субстанции, что предполагает большее влияние препарата на синтез дофамина в отростках и пресинаптических окончаниях, чем в телах дофаминовых нейронов черной субстанции, посылающих свои проекции в хвостатое ядро.
Активность МАО Б, фермента участвующего в утилизации дофа
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.