ФИЗИОЛОГИЯ РАЗВИТИЯ =
УДК 636.2:612.621
ОСВОБОЖДЕНИЕ Са2+ ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ДЕПО ООЦИТОВ СВИНЕЙ НА РАЗНЫХ СТАДИЯХ РОСТА © 2011 г. В. Ю. Денисенко, Т. И. Кузьмина
Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных РАСХН196600 Санкт-Петербург, Пушкин, Московское шоссе, д. 55а E-mail: prof.kouzmina@mail.ru Поступила в редакцию 05.11.10 г.
Окончательный вариант получен 30.04.10 г.
Исследовано освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней с помощью Са2+-чув-ствительного флуоресцентного зонда хлортетрациклин. Селекция ооцитов на растущие и завершившие стадию роста проведена с помощью витального красителя брилиантового голубого (ВСВ); окрашенные ооциты (BCB "+") определяли как закончившие рост, неокрашенные (ВСВ "—") находились на завершении фазы роста. В ВСВ "+" и ВСВ "—" ооцитах пролактин, теофиллин, ГТФ и ГДФ вызывают освобождение Са2+ из внутриклеточных депо. В завершивших стадию роста ооцитах совместное действие пролактина и ГТФ активирует дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо, в котором участвует протеинкиназа С; в растущих ооцитах совместное действие пролактина и ГТФ не вызывает дополнительного выхода Са2+ из внутриклеточных депо. Совместное действие теофиллина и ГДФ в растущих и завершивших стадию роста ооцитах способствует дополнительному освобождению Са из внутриклеточных депо, и это освобождение регулируется протеинкиназой А. Полученные данные свидетельствуют о различных путях освобождения Са2+ из внутриклеточных депо в растущих и завершивших стадию роста ооцитах свиньи.
Ключевые слова: кальций, ооциты свиньи, ВСВ.
Увеличение концентрации внутриклеточного кальция в клетках происходит вследствие входа внеклеточного кальция и освобождения кальция из внутриклеточных депо (Berridge, Irvine, 1989; Ber-ridge, 2004). Основными внутриклеточными депо, из которых осуществляется выход кальция, являются рианодин- и 1Р3-чувствительные. В ооцитах различных видов животных показано присутствие депо обоих типов (Yue et al., 1995; Machaty et al., 1997). При созревании ооцитов происходят интрацеллю-лярные преобразования, часть из которых связана с формированием внутриклеточных депо. В незрелых ооцитах свиньи внутриклеточные депо кальция окончательно не сформированы, при завершении роста ооцитов отмечается увеличение размера внутриклеточных депо, и количество кальция, запасенного в них, возрастает (Machaty et al., 1997).
Бриллиантовый голубой (ВСВ) является витальным красителем, который свидетельствует о внутриклеточной активности фермента глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы (G6PDH) (Alm et al., 2005). В ооцитах синтезируются различные белки (Wssarman, 1988), включая G6PDH. Активность этого фермента существенна в растущих ооцитах, однако, в клетках, завершивших стадию роста, она снижается. ВСВ-тест
основан на способности G6PDH конвертировать ВСВ из голубой окраски в бесцветную. Это наблюдается в растущих ооцитах (Ericsson et al., 1993). В цитоплазме завершивших стадию роста ооцитах ВСВ не теряет свой цвет.
Цель настоящего исследования — идентификация путей сигнальной трансдукции в ооцитах в зависимости от их функционального статуса (растущие и завершившие стадию роста) на основе исследования флуктуации содержания Са2+ во внутриклеточных депо.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА
В качестве объекта исследований использовали ооциты свиней, забитых на мясокомбинате. Ооцит-кумулюсные комплексы выделяли из яичников на стадии фолликулярного роста, без признаков видимой патологии аспирацией фолликулов диаметром 3—6 мм. В опытах использовали ооциты округлой формы, с тонкогранулированной ооплазмой и равномерной по ширине зоной пеллюцида. Инкубацию выделенных ооцитов проводили в модифицированной инкубационной среде Дюльбекко без
51
4*
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
X
X
JL
X
Рис. 1. Влияние ингибирования протеинкиназы С на стимулированное пролактином и ГТФ освождение Са2+ из внутриклеточных депо ВСВ "+" ооцитов свиней. По горизонтали: 1 — контрольные клетки; 2 — активация пролактином в концентрации 50 нг/мл; 3 — 10 мкМ ГТФ; 4 — совместное действие пролактина и ГТФ; 5 — действие 10 нг/мл Ro 31-8220; 6 — действие Ro 31-8220 с последующей обработкой пролактином; 7 — действие Ro 31-8220 с последующей обработкой ГТФ; 8 — 10 нг/мл Ro 31-8220 и последующее совместное действие пролактина и ГТФ. По оси ординат — интенсивность флуоресценции ХТЦ, усл. ед. Различия достоверны при: Р < 0.001 (1 и 2; 1 и 3; 2 и 4; 3 и 4). Здесь и далее
представлены изменения Ca' периментах.
2+
полученные в 4—5 экс-
Интенсивность флуоресценции зонда ХТЦ измеряли на флуориметрической установке, состоящей из люминесцентного микроскопа, снабженного необходимыми светофильтрами и фотометрической насадкой ФМЭЛ-1А. Комплекс ХТЦ-Са2+-мембрана возбуждали светом 380—400 нм, флуоресценцию регистрировали в области 530 нм. Интенсивность флуоресценции измеряли в усл. ед. Длительность воздействия ультрафиолетового излучения на ооциты при проведении измерений не превышала 5 сек.
В работе использовали следующие реагенты: инкубационную среду Дюльбекко, не содержащую СаС12, ингибитор протеинкиназы С Ro 31-8220, ингибитор протеинкиназы А H-89, теофиллин, ВСВ ("Sigma", США), ХТЦ ("ICN", США), гуанозин-трифосфат, гуанозиндифосфат ("Reanal", Венгрия), гипофизарный бычий пролактин (20.0 МЕ/мг; Институт эндокринологии, Москва). Ro 31-8220 и H-89 растворяли в диметилсульфоксиде, остальные реактивы в среде Дюльбекко.
Достоверность различия сравниваемых средних значений для 4—5 независимых экспериментов оценивали с помощью i-критерия Стьюдента.
1
2
3
4
5
6
7
8
СаС12, содержащей 36 мг/л пирувата Na и 1 г/л глюкозы.
При приготовлении маточного раствора ВСВ (бриллиантового голубого кристаллического) использовали среду PBS с 0.4%-ным ВСА. Концентрация ВСВ в маточном растворе составляла 260 мкМ. Окрашивание ооцитов свиньи проводили совместно с клетками кумулюса при концентрациии ВСВ 13 мкМ. Продолжительность инкубации ооцитов в присутствии красителя составляла 60 мин при температуре 37°С. Объем раствора красителя, необходимого для окраски одного ооцита, был равен 200 мкл. По цвету окраски ооциты распределяли на две группы — окрашенные (завершившие стадию роста) и неокрашенные (растущие). Выбор концентрации и времении экспозиции основывался на данных, полученных Roca (Roca et al., 1998).
Уровень содержания кальция во внутриклеточных депо ооцитов свиней измеряли с помощью флуоресцентного зонда хлортетрациклин (ХТЦ). Ооциты экспонировали в течение 5 мин при 37°С в инкубационной среде, содержащей 40 мкМ ХТЦ. Затем клетки три раза отмывали в инкубационной среде и переносили на специальное кварцевое стекло с ячейками объемом 0.05 мл. Зависимую от Са2+ флуоресценцию ХТЦ регистрировали в ооцитах в среде Дюльбекко.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
После селекции исходной популяции ооцит-ку-мулюсных комплексов с учетом морфологических критериев (число слоев окружающего ооцит куму-люса, гомогенность ооплазмы и ширина зоны пел-люцида), ооцит-кумулюсные комплексы, без признаков видимой дегенерации, инкубировали в среде с ВСВ. В экспериментах использовали окрашенные ооциты (ВСВ "+") и ооциты, лишенные окраски (ВСВ "—"). Показано, что окрашенные ВСВ ооциты свиней значительно больше в диаметре, чем неокрашенные (113 мкм против 103 мкм) (Roca et al., 1998). В соответствии с литературными данными ВСВ "+" ооциты определены, как завершившие стадию роста, а ВСВ "—" ооциты — находящиеся в фазе ее завершения (Alm et al., 2005). Результаты экспериментов по оценке влияния ингибирования протеинкиназы С на вызванное пролактином и ГТФ освобождение Са2+ в ВСВ "+" ооцитах свиней показаны на рис. 1. Внесение в среду инкубации пролактина в концентрации 50 нг/мл или ГТФ в концентрации 10 мкМ приводило к освобождению Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов. Совместное действие пролактина и ГТФ вызывало дополнительный выход Са2+ из внутриклеточных депо. Обработка ооцитов ингибитором протеинкиназы С соединением Ro 31-8220 в концентрации 10 нг/мл также приводила к освобождению Са2+ из внутриклеточ-
ОСВОБОЖДЕНИЕ Са2+ ИЗ ВНУТРИКЛЕТОЧНЫХ ДЕПО ООЦИТОВ СВИНЕЙ
53
1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0
1.4 1.2 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0
J___I___I___L
1234567
а
8
3
4
Рис. 2. Влияние пролактина и ГТФ на освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ВСВ "—" ооцитов свиней. По горизонтали: 1 — контрольные клетки; 2 — активация пролактином в концентрации 50 нг/мл; 3 — 10мкМ ГТФ; 4 — совместное действие пролактина и ГТФ. По оси ординат — интенсивность флуоресценции ХТЦ, усл. ед. Различия достоверны при: Р < 0.01 (1 и 2; 1 и 3).
ных депо. Последующее добавление к обработанным ингибитором ооцитам пролактина или ГТФ не изменяло выход Са2+ из внутриклеточных депо по сравнению с необработанными ооцитами, однако, при совместном действии пролактина и ГТФ в обработанных ингибитором протеинкиназы С ооцитах не отмечали дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо.
Результаты экспериментов об эффектах пролактина и ГТФ на выход Са2+ из внутриклеточных депо ВСВ "—" ооцитов свиней представлены на рис. 2. Показано, что в таких ооцитах добавление пролактина или ГТФ стимулирует освобождение Са2+ из внутриклеточных депо. Однако, в отличие от ВСВ "+" ооцитов в ВСВ "—" ооцитах совместное действие пролактина и ГТФ не вызывает дополнительного освобождения Са2+ из внутриклеточных депо.
Результаты влияния ингибирования протеинки-назы А на стимулированное теофиллином и ГДФ освобождение Са2+ из внутриклеточных депо ооцитов свиней показаны на рис. 3. В ВСВ "+" ооцитах использование теофиллина в концентрации 10 мМ или ГДФ в концентрации 100 мкМ вызывало освобождение Са2+ из внутриклеточных депо (рис. 3, а). Совместное действие теофиллина и ГДФ стимулировало в ооцитах дополнительное освобождение Са2+ из внутриклеточных депо. Обработка клеток ингибитором протеинкиназы А соединением Н-89 в концентрации 40 мкМ не влияла на уровень содержания Са2+ во внутриклеточных депо. Воздействие ингибитора протеинкиназы А также не оказывало влияние на стимулированное теофиллин
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.