ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК, 2015, том 462, № 5, с. 613-615
БИОХИМИЯ, БИОФИЗИКА, МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ
УДК 577.171.52:577.17.05
ОТДАЛЕННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ПРЕНАТАЛЬНОЙ БЛОКАДЫ РЕЦЕПТОРОВ К ГОНАДОТРОПИН-РИЛИЗИНГ-ГОРМОНУ
В ТИМУСЕ КРЫС © 2015 г. В. И. Мельникова, Н. В. Лифанцева, С. Н. Воронова, Л. А. Захарова
Представлено академиком РАН Р.М. Хаитовым 17.12.2014 г. Поступило 19.12.2014 г.
DOI: 10.7868/S0869565215170260
Согласно современным представлениям, взаимная регуляция нейроэндокринной и иммунной систем закладывается уже на начальных этапах их развития и осуществляется на протяжении всего онтогенеза. Ключевая роль в этом взаимодействии принадлежит гипоталамическим нейро-пептидам [1, 2]. Одной из наиболее важных сигнальных молекул в нейро-эндокринно-иммун-ном взаимодействии является гонадотропин-рилизинг-гормон (ГРГ), основная роль которого в гипоталамусе связана с регуляцией репродуктивной функции организма [3]. К настоящему времени хорошо изучено регуляторное влияние ГРГ на функционирование иммунной системы в постнатальном периоде онтогенеза. У половозрелых животных помимо мозга, гонад и плаценты ГРГ и его рецепторы экспрессируются в клетках иммунной системы и модулируют функции лимфоцитов в тимусе, селезенке и периферической крови [1, 4, 5]. В то же время данные об участии ГРГ в раннем развитии иммунной системы немногочисленны. Ранее нами было показано, что ГРГ и его антагонист способны оказывать влияние на функциональную активность тимоцитов уже в пренатальном периоде развития [6, 7]. Введение плодам in utero антител к ГРГ или антагониста ГРГ приводит к снижению пролифератив-ного ответа эмбриональных тимоцитов на мито-ген, а добавление ГРГ в культуральную среду усиливает действие митогена [7]. Известно, что в раннем онтогенезе, в отличие от постнатального периода, нейроэндокринная система осуществляет не только регуляторную функцию, но и контролирует развитие периферических органов [8]. В период онтогенеза, предшествующий формированию гематоэнцефалического барьера, синтезируемый в мозге ГРГ может поступать в общую
Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской Академии наук, Москва E-mail: v melnikova@mail.ru
циркуляцию [9]. Концентрация этого гормона в периферической крови плодов на порядок выше, чем у взрослых животных, что предполагает его участие в регуляции развития периферических органов-мишеней [7, 10]. В связи с этим в настоящей работе исследовали отдаленные последствия воздействия антагониста ГРГ на формирование Т-системы иммунитета, а также была изучена экспрессия рецепторов к ГРГ в эмбриональном тимусе.
В работе использовали крыс популяции Wistar с датированной беременностью. На 17-й день эмбрионального периода развития (Э17) плодам in utero вводили по 20 мкг антагониста рецептора ГРГ ([D-pGlu,D-Phe26,Pro3-LHRH], "Sigma", США) в 10 мкл стерильного физиологического раствора, контрольным плодам вводили 10 мкл 0.9%-го раствора NaCl. У родившегося потомства на 20-й и 40-й дни постнатального развития (П20, П40) оценивали функциональную активность Т-лимфоцитов тимуса по пролиферативному ответу, индуцированному митогеном Конканавали-номА (КонА) по ранее описанному методу [7]. В отдельных экспериментах антагонист ГРГ вводили однократно внутрибрюшинно крысятам на 3-й день постнатального периода (П3) по 50 мкг в 25 мкл физиологического раствора и оценивали индуцированный пролиферативный ответ тимо-цитов на стадиях П20 и П40.
Экспрессию рецепторов ГРГ оценивали методом Вестерн-блоттинга. Осветленные гомогенаты готовили из целых тимусов и отдельно из тимоцитов и стромальных элементов. Для разделения клеточных популяций тимусы гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе и пропускали через капроновый фильтр. Электрофорез белков в поли-акриламидном геле и Вестерн-блоттинг (10 мкл осветленного гомогената, 40 мкг белка на дорожку) проводили, как описано ранее [11]. Для окрашивания мембран использовали поликлональные антитела кролика к рецептору ГРГ в разведении 1:500
614
МЕЛЬНИКОВА и др.
(а) (б)
------ — -46 кДа * ^^^^ -46 кДа
Э16 Э17 Э19 Э21 П3 + Тимоциты Строма
—------ кДа
+ Э17 Э18 Э21
Рис. 1. (а) — возрастная динамика экспрессии рецепторов ГРГ в тимусе крыс на 16-й, 17-й, 18-й, 19-й и 21-й дни эмбрионального развития (Э16, Э17, Э18, Э19, Э21) и 3-й день постнатального развития (П3); (б) — экспрессия рецепторов к ГРГ в тимоцитах и стромальных элементах тимуса на 18-й день эмбрионального развития. В качестве положительного контроля (+) использовали аденогипофиз (П3). Приведены Вестерн-блоты белков осветленных гомогенатов с использованием поликлональных антител к рецепторам ГРГ.
("Alomone Labs", Израиль) и конъюгированные с пероксидазой хрена антитела к IgG кролика в разведении 1:10000 ("Thermo Scientific", США). Статистическую обработку данных проводили с помощью непараметрического критерия Вилкоксо-на. Результаты представляли в виде M ± т.
В тимусе плодов, начиная с эмбрионального периода, равного 16-му дню (Э16), были обнаружены рецепторы к ГРГ (рис. 1а). Максимальный уровень их экспрессии наблюдали на стадиях Э17—Э18 (рис. 1а). В этот период развития рецеп-
50000 -
§ g 40000 -
4 н я е
5
£ 2 30000 -
я •
<Г< CN
К
g J 20000 -
10000 -
0
П20 П40
Возраст, дни
Рис. 2. Индуцированный Кон А (2.5 мкг/мл) проли-феративный ответ лимфоцитов тимуса крыс, которым однократно вводили ГРГ-антагонист на 17-й день эмбрионального развития. Контрольные животные получали 0.9% раствор №С1. Пролиферативную активность лимфоцитов оценивали на 20-й и 40-й дни постнатального развития (П20 и П40); * р < 0.05 по сравнению с контролем.
торы были выявлены главным образом на тимоцитах (рис. 1б).
Однократное введение плодам в день Э17 антагониста рецепторов ГРГ приводило к достоверному снижению пролиферативного ответа тимо-цитов на митоген у крысят в дни П20 и П40 (рис. 2). В отличие от плодов однократное введение антагониста рецепторов ГРГ крысятам в день П3 не вызывало отдаленных изменений (сравнение с показателями П20) в функциональной активности Т-лим-фоцитов (31870 ± 2740 и 29486 ± 3184 имп./мин соответственно ).
Влияние ГРГ потенциально может реализовы-ваться несколькими путями. ГРГ, поступающий в кровь плода из мозга и периферических источников (плацента), может через соответствующие рецепторы напрямую воздействовать на клетки-мишени, принимающие участие в морфогенезе тимуса. Наблюдаемые изменения функциональной активности Т-клеток связаны, по-видимому, с тем, что ингибирование рецепторов к ГРГ у плодов приводит к стойким необратимым изменениям в стромальных элементах тимуса, в частности эпителиальных и дендритных клетках. Обнаруженная экспрессия рецепторов к ГРГ на тимоци-тах не противоречит данному предположению, поскольку вслед за миграцией первых предшественников Т-лимфоцитов в эмбриональную закладку тимуса в период Э13—Э16 начинается активное взаимодействие элементов стромы тимуса и тимоцитов, которые реципрокно поддерживают дифференцировку друг друга [12, 13]. Вероятно, ГРГ является одной из регуляторных молекул, участвующих в данном взаимодействии.
Кроме того, ГРГ может опосредованно влиять на развитие иммунной системы через стойкие изменения в других компонентах нейроэндокрин-ной системы. Однако у крыс гипоталамический контроль секреции гонадотропинов гипофизом
I | Контроль Ц ГРГ-антогонист
I
ДОКЛАДЫ АКАДЕМИИ НАУК том 462 № 5
2015
ОТДАЛЕННЫЕ ПОСЛЕДСТВИЯ ПРЕНАТАЛЬНОЙ БЛОКАДЫ
615
формируется ко дню Э21 одновременно с формированием аксональных путей транспорта ГРГ к портальной циркуляции и созреванием рецепторов к ГРГ на гонадотропоцитах [9]. В связи с этим представляется более вероятным, что обнаруженные эффекты антагониста ГРГ обусловлены его прямым влиянием на формирование тимуса на Э17. Высокий уровень экспрессии рецепторов к ГРГ в период Э17—Э18, так же как и отсутствие отдаленных последствий при однократном введении антагониста ГРГ постнатальным крысам, свидетельствуют о важном значении ГРГ в регуляции формирования тимуса именно в конце второй декады внутриутробного развития.
Согласно данным литературы, ГРГ способен также влиять на формирование Т-системы иммунитета в первые недели после рождения. Хроническое введение антагониста ГРГ крысам в течение первых пяти дней после рождения приводит к стойкому угнетению Т-клеточного иммунитета [14]. Однако, как было установлено авторами, в данной экспериментальной модели эффекты антагониста ГРГ реализуются через влияние на секрецию гонадотропинов и половых стероидов, а не непосредственно на тимус.
Совокупность полученных данных позволяет нам сделать вывод о важной морфогенетической роли нейропептида ГРГ в критический период формирования тимуса.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант № 13—04—00191-а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Morale M.C., Gallo F., Tirolo C., Testa N., Caniglia S., Marietta N, Spina-Purrello V., Avola R, Caucci F., To-
masi P., Delitala G., Barden N., Marchetti B. // Immunol. Cell. Biol. 2001. V. 79. № 4. P. 400-417.
2. Tanriverdi F., Silveira L.F.G., MacColl G.S., Bou-louxP.M.G. // J. Endocrinol. 2003. V. 176. P. 293-304.
3. Kordon C., Drouva S., Escalera G.M., Weiner R.I. The Physiology of Reproduction. N.Y: Raven Press, 1994. P. 1621-1681.
4. Azad N., Emanuele N.V., Halloran M.M., Tentler J., Kelley M.R. // Endocrinology. 1991. V 128. № 3. P. 1679-1681.
5. Marchetti B., Gallo F., Farinella Z., Tirolo C., Testa N., Romeo C, Morale M.C. // Ann. N.Y Acad. Sci. 1998. V. 840. P. 205-248.
6. Захарова Л.А., Мельникова В.И., Ермилова И.Ю., Адамская Е.И., Кузнецова Т.А., Сапронова А.Я. // ДАН. 2003. Т. 389. № 5. С. 708-710.
7. Zakharova L.A., Ermilova I.Y., Melnikova V.I., Maly-ukova I.V., Adamskaya E.I. // Neuroimmunomodula-tion. 2005. V. 12. № 2. P. 85-91.
8. Buznikov G.A., Shmukler Yu.B., Lauder J.M. // Neuro-sci. Behav. Physiol. 1999. V. 29. № 1. P. 11-21.
9. Угрюмов М.В. Механизмы нейроэндокринной регуляции. М.: Наука, 1999. 299 с.
10. Лаврентьева А.В., Сапронова А.Я., Адамская Е.И., Мельникова В.И., Прошлякова Е.В., Бабичев В.Н., Угрюмов М.В. // Нейрохимия. 2004. Т. 21. № 1. С. 27-33.
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.