НЕЙРОХИМИЯ, 2007, том 24, № 1, с. 69-73
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ^^^^^^^^^^^^ РАБОТЫ
УДК 615.21.015
ОЦЕНКА АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ НООТРОПНОГО ДИПЕПТИДА НООПЕПТ НА МОДЕЛИ Fe2+-ИНДУЦИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ ЛИПОПРОТЕИНОВ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА IN VITRO
© 2007 г. Т. Н. Федорова1, К. С. Ус2*, Р. У. Островская2
1ГУ НИИ неврологии РАМН, Москва 2ГУ НИИ фармакологии им. ВВ. Закусова РАМН, Москва
На модели Fe2+-HHflyu;HpoBaHHoft хемилюминесценции (ХЛ) липопротеинов сыворотки крови здоровых доноров in vitro изучена антиоксидантная активность ноотропного препарата дипептидной природы но-опепт (этиловый эфир ^фенилацетил-Ь-пролилглицина, ГВС-111). Проведена сравнительная оценка эффективности ноопепта и его непептидного прототипа, пирацетама, а также антиоксиданта, действующего по механизму "ловушки свободных радикалов" PBN (N-tert-бутил-а-фенилнитрона) и маннита -препарата, применяемого в качестве нейропротектора при лечении отека мозга. Показано действие ноопепта на длительность латентного периода ХЛ (т), отражающего эндогенный антиоксидантный потенциал. Максимальное увеличение этого показателя отмечено под влиянием ноопепта (в 3.4 раза по отношению к контролю) и PBN (в 3 раза по отношению к контролю). В то же время ноопепт оказался более эффективным, поскольку действовал при более низких концентрациях, чем PBN.
Полученные данные, отражающие способность ноопепта защищать липопротеины плазмы крови человека от Fe2+-индyциpoвaннoгo перекисного окисления липидов в сочетании с выявленными ранее ноотропными и нейропротекторными свойствами этого системно-активного дипептида, позволяют считать его перспективным для клинического применения при инсульте и других состояниях, связанных с дефицитом эндогенной антиоксидантной системы.
Ключевые слова: ноопепт, природные и синтетические антиоксиданты, хемилюминесценция, липопротеины крови человека.
Активация перекисного окисления липидов (ПОЛ) - важный компонент метаболического каскада, развивающегося при разнообразных заболеваниях головного мозга (инсульт, травма мозга, нейродегенеративные заболевания, нейро-инфекции). В связи с этим в клинике возникает необходимость применения препаратов, проявляющих антиоксидантные свойства. Известно, что многие из препаратов, принадлежащих к классу ноотропов, основным представителем которых является пирацетам [1], сочетают способность восстанавливать когнитивные функции, нарушенные повреждающими воздействиями, с ней-ропротективным эффектом, в реализации которого определенная роль может принадлежать нормализации взаимоотношений про- и антиок-сидантных систем. В литературе имеются данные о том, что пирацетам проявляет антиоксидантные свойства [2, 3]. Однако недостаточная эффективность пирацетама и отсутствие убедительных данных о механизме его действия побуждают к поиску других ноотропов с более высокой био-
* Адресат для корреспонденции: 125315, Москва, Балтийская ул., д. 8; факс: (495) 151-12-61; тел. (495) 601-24-14; e-mail: aksinia01@rambler.ru
логической устойчивостью [4]. Представления о дипептидах как о специфической группе, отличающейся высокой биологической активностью, подтверждены исследованиями карнозина и родственных ему соединений [5]. Оригинальный подход к созданию высокоэффективных ноотропов, разрабатываемый в Институте фармакологии РАМН, состоит в создании дипептидов, содержащих одну из эндогенных пирролидинкарбоновых аминокислот, пироглутамата или пролина [6, 7]. На основании этого подхода, базирующегося на гипотезе о пептидергическом механизме действия пирацетама, создана серия ^ацильных производных пролина, из которой на основании выраженного антиамнестического и нейропротективного действия этиловый эфир ^фенилацетил-Ь-про-лилглицина, ноопепт, был отобран для дальнейших исследований [8, 9].
Экспериментальная оценка ноопепта показала, что препарат превосходит пирацетам не только по уровню эффективных доз (в 1000 раз меньших для ноопепта, чем для пирацетама), но и по спектру мнемотропной активности. В отличие от пирацетама, облегчающего только ранние фазы обработки информации, ноопепт влияет также на
процессы консолидации, хранения и извлечения информации в мозге [10]. Ранее были получены экспериментальные доказательства его способности предотвращать активацию ПОЛ и дефицит антиоксидантной системы, вызванные иммобилизацией животных [11, 12]. В условиях экспериментальной ишемии мозга [13] и на различных моделях нейрональных культур продемонстрировано выраженное нейропротективное действие ноопепта, проявляющееся в предотвращении ускоренной гибели нейронов и повышении их выживаемости [14]. Показано, что его основу составляет антиоксидантный эффект, способность блокировать нейротоксическое действие ионов кальция [15] и глутамата [16], тормозить высвобождение глутамата [17], проявлять противовоспалительный эффект [18] и улучшать реологические свойства крови [19].
Лимитующим фактором внедрения новых ней-ропротекторов в клиническую практику является отсутствие методических подходов, которые бы позволяли оценить их антиоксидантный потенциал. Настоящее исследование выполнено с целью количественной оценки антиоксидантного действия ноопепта на модели Fe2+-индуцированной хемилюминесценции (ХЛ) липопротеинов сыворотки крови здоровых доноров in vitro.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Для оценки влияния ноопепта на параметры ПОЛ был использован хемилюминесцентный анализ Fe2+-индуцированного окисления липопротеинов крови здоровых доноров. В качестве препаратов сравнения использовали стандартный ноотропный препарат пирацетам [1]; PBN (а-фе-нил^4еП-бутилнитрон), являющийся "ловушкой" свободных радикалов [20]; маннит - препарат, применяемый в клинике в качестве нейро-протектора в основном при отеке мозга [21].
Анализ хемилюминесценции проводили методом, описанным ранее [22-24]. Кровь брали у доноров натощак и выделяли из нее сыворотку, затем к 200 мкл сыворотки добавляли 2000 мкл 0.28% СаС12 и 40 мкл 1% гепарина, после центрифугирования (3000 об/мин, в течение 15 мин) получали суспензию липопротеинов низкой и очень низкой плотности, которую использовали в качестве субстрата окисления. К суспензии липопротеинов добавляли 900 мкл фосфатного буфера, рН 7.45 (60 мМ КН2РО4, содержащего 105 мМ КС1). Кювету с суспензией липопротеинов помещали в измерительную камеру хемилюминомет-ра "Luminometer-1251" ("LKB", Швеция) и регистрировали фоновую хемилюминесценцию, проводя измерение в двух-трех параллельных пробах. Для инициации хемилюминесценции в кювету вносили FeSO4 в конечной концентрации 2.5 мМ. Измеряли амплитуду быстрой вспышки
ХЛ (И, тВ), характеризующую уровень предобра-зованных продуктов ПОЛ (преимущественно гидроперекисей липидов); длительность латентного периода ХЛ (т, с), отражающего эндогенный антиоксидантный потенциал; максимальную величину ХЛ (Н, тВ), характеризующую способность липопротеинов к перекисному окислению; из угла наклона кривой ХЛ рассчитывали скорость окисления липопротеинов (в относительных единицах за секунду). Растворы исследуемых соединений (рН 7.45) вместе с компенсирующими объемами фосфатного буфера добавляли в исследуемую пробу за 30 с до внесения FeSO4. Действие исследуемых соединений сравнивали в диапазоне концентраций от 10-6 до 2 х 10-3 М . Изменение параметров ХЛ выражали в процентах по отношению к контрольным значениям для проб, в которые добавляли соответствующие объемы стандартного буфера.
Для статистической обработки результатов применяли компьютерную программу ВкюШ с использованием параметрического ¿-критерия Стьюдента. Результаты представлены в виде М ± S.EM.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследуемые соединения влияли на изучаемые показатели хемилюминесценции в разной степени. Как следует из рисунка "а", значительное ингибирующее действие на величину начальной вспышки ХЛ (И) выявлялось у РВ^ оно усиливалось пропорционально концентрации данного препарата (на 92% по отношению к контролю при максимальной концентрации). Полученные данные свидетельствуют о способности этого соединения взаимодействовать с предобразованны-ми гидроперекисями. Пирацетам и ноопепт в диапазоне применяемых концентраций достоверных изменений этого показателя не вызывали.
Максимальная величина ПОЛ (Н) (рисунок "б") подавлялась только РВ^ причем этот эффект начинал проявляться при его более высоких концентрациях в пробе (10-4 - 2 х 10-3 М). Выявленная способность PBN подавлять быструю вспышку ХЛ (И) и понижать максимальную величину ПОЛ (Н) соответствуют представлению о нем как о "ловушке свободных радикалов" и ингибиторе ПОЛ. Аналогичный эффект ранее был нами описан для другого известного антиоксиданта прямого действия - тролокса, гидрофильного синтетического аналога витамина Е [25].
Скорость окисления липопротеинов (рисунок "в") также существенно снижалась при добавлении в среду инкубации РВ^ причем этот эффект развивался дозозависимым путем. Ноотропные препараты пирацетам и ноопепт не оказывали влияния на этот параметр ХЛ.
Процент по отношению к контролю
140 г Влияние исследуемых соединений на уровень предобразованных гидроперекисей, И
120^ „ (а)
100р
80-
60 40 20
—♦— Hоопепт ■ -о- - PBN
— д— Пирацетам - X - - Mаннит
olio-6
10-
10-
10-
10-
Процент по отношению к контролю
140 г Mаксимальная величина XH, H
120 100' so 60 40 20
(б)
■ -D— А --X-
■ Hоопепт - PBN
Пирацетам
■ Mаннит
SU
0 -6 l0-6
l0-
l0-
l0-
l0-
140 г
120.г
l00
s0
60
40
20
0 l0-
Скорость окисления
(В)
-и
-ф— Hоопепт
-Ï — -
- -о - PBN
- д— Пирацетам
- - X - - Mаннит
\
10-5 10-4 10-3 Концентрация, M
400 350 300 250 200 150 f
Влияние исследуемых соединений на резистентность липопротеинов к ПОЛ
- -о - PBN
— д— Пирацетам
(г) i
l0-
10-4 10-3 Концентрация, M
10-
„2+
Влияние ноопепта, пирацетама, PBN и маннита на параметры Fe2, -индуцированной хемилюминесценции липопротеинов сыворотки крови здоровых доноров. Результаты представлены в процентах по отношению к контролю (контроль - 100 %). а - уровень предобразованных гидроперекисей липидов (h); б - максимальная величина ПОЛ (Н); в -скорость окисления липопротеинов; г - резистентно
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.