ИЗВЕСТИЯ РАН. СЕРИЯ ФИЗИЧЕСКАЯ, 2012, том 76, № 12, с. 1507-1510
УДК 53.083;544.02;577.334
ОЦЕНКА АНТИРАДИКАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ВОДЫ С МОДИФИЦИРОВАННЫМ ИЗОТОПНЫМ СОСТАВОМ С ПОМОЩЬЮ ЯМР-, ЭПР- и МАСС-СПЕКТРОСКОПИИ
© 2012 г. М. Г. Барышев1, 2, А. А. Басов3, С. Н. Болотин1, С. С. Джимак1, 2, Д. В. Кашаев1, С. Р. Федосов3, В. Ю. Фролов1, Д. И. Шашков1, Д. А. Лысак1, А. А. Тимаков4
E-mail: jimack@mail.ru
Методом ЯМР-спектроскопии изучена динамика изменения содержания дейтерия в плазме крови лабораторных животных при употреблении воды с модифицированным изотопным составом. Изменение содержания дейтерия в лиофилизированных тканях животных определяли методом масс-спектрометрии. Содержание парамагнитных центров в норме и патологии определено при помощи ЭПР-спектрометра.
ВВЕДЕНИЕ
Метод электронного парамагнитного резонанса (ЭПР) широко применяется к решению ряда медико-биологических задач [1—3], он также является основным методом для изучения парамагнитных частиц присутствующих в биологических системах. Свободные радикалы — это парамагнитные частицы, имеющие важное биологическое значение. Они принимают активное участие в регуляции многих внутриклеточных процессов [4], включая иммунные механизмы, обезвреживание ксенобиотиков, апоптоз, метаболизм биологически активных соединений. Одним из перспективных пищевых веществ для коррекции ан-тиоксидантного потенциала организма является вода с модифицированным изотопным составом (ВМИС), например вода с пониженным содержанием дейтерия [5].
Замена обычной воды на тяжелую приводит к уменьшению электропроводности растворов электролитов в основном из-за увеличения вязкости и, следовательно, уменьшения подвижности ионов. Тяжелая вода в основном влияет на активные свойства возбудимой мембраны. Присутствие дейтерия в биологических системах приводит к изменениям структуры и свойств ДНК и белков. При 30%-ной замене обычной воды на тяжелую у микроорганизмов останавливаются жизненные процессы, млекопитающие (например, лабораторные крысы) умирают [6].
1 ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный университет", Краснодар.
2 Южный научный центр РАН, лаборатория "Проблем природных и новых материалов", Ростов-на-Дону.
3 ФГБОУ ВПО "Кубанский государственный медицинский университет Минздравсоцразвития", Краснодар.
4 ООО "МТК Айсберг", Москва.
В плазме крови человека и животных содержание дейтерия немного превышает его содержание в питьевой воде и составляет в зависимости от региона проживания 140—160 ppm. Вода с модифицированным изотопным составом с пониженным содержанием дейтерия (ВМИС ССД) предположительно позволяет проводить профилактику и коррекцию окислительного стресса и соответственно контролировать образование свободных радикалов в организме [7].
Цель настоящего исследования — изучение влияния количественного содержания дейтерия в плазме крови и органах лабораторных животных на интенсивность свободнорадикального окисления методами ЯМР-, ЭПР- и масс-спектромет-рии в физиологических условиях и при воспалительных процессах.
Одним из наиболее удобных методов для измерения дейтериевого состава плазмы крови является ЯМР-спектроскопия [8]. Однако этот метод не позволяет измерить содержание дейтерия в тканях органов лабораторных животных. Эта задача была решена при помощи изотопного масс-спектрометра.
МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТА
Измерение спектров ЭПР проводили при комнатной температуре на спектрометре JES Fa 300 (JEOL, Япония) в X-диапазоне. Условия измерения: СВЧ-мощность — 1 мВт, частота микроволнового излучения — 9144 МГц, амплитуда высокочастотной модуляции — 0.1 мТл. Образцы подвергали лиофильной сушке, измеряли в кварцевой ампуле (5 мм), масса навески в зоне резонатора составляла 0.0300 г. Концентрацию парамагнитных центров в образцах определяли путем сравнения с сигналом стандартного образца (TEMPOL),
1508
БАРЫШЕВ и др.
Поглощение
0.8
135.7 ppm
0.6
0.4 -
0.2 -
H
VD
D
H2C CH3
S
O
150.0 ppm
Г
AAÀ.
0 Г . I_i_|_i__I_1_I_1_I_1_I_1_I_1_I_1_I_1_I_1_I_1_I
5.1 4.9 4.7 4.5 4.3 4.1 3.9 3.7 3.5 3.3 3.1 2.9 2.7 2.5
Химический сдвиг 2D
Рис. 1. Соотношения интегральных интенсивностей 2D ЯМР-сигнала HDO, относительно 2D ЯМР-сиг-нала DMSO-D1.
интегральную интенсивность сигнала ЭПР в исследуемых образцах — путем двойного численного интегрирования [9].
Воду с пониженным содержанием дейтерия получали на установке, разработанной в Кубанском государственном университете [10]. Исходная концентрация дейтерия в получаемой воде 40 ppm.
Определение концентрации дейтерия в биологических жидкостях были проведены на импульсном ЯМР-спектрометре JEOL JNM-ECA 400 MHz. Съемку спектров проводили на соответствующей резонансной частоте ядер дейтерия — 61.4 МГц. Параметры съемки: 6.7 с (acquisition time), 20 с (relaxation delay), 5.6 мкс (x-pulse), 0.15 Гц (resolution). Температура съемки — 25°C, при этом точность стабилизации — 0.2°C. Измерения проводили с использованием 5-мм ампулы, внутри которой был строго зафиксирован запаенный капилляр, содержащий откалиброванную в определяемой концентрационной шкале смесь дейте-рированного и недейтерированного диметил-сульфоксида (DMSO), дающего 2D ЯМР-сигнал в области 3.4 м.д. (относительно (CD3)4Si), в то время как 2D ЯМР-сигнал HDO находится в области 4.7 м.д. (относительно (CD3)4Si).
Обработка полученных спектров заключалась в определении соотношения интегральных интенсивностей 2D ЯМР-сигнала HDO, содержащейся в исследуемом образце относительно 2D ЯМР-сигнала DMSO-Dj (рис. 1), интенсивность которого, в свою очередь, была определена при
таких же условиях относительно стандартов — образцов воды с точно определенным содержанием дейтерия (3.7, 51, 150 ppm). Измерения каждого образца проводили неоднократно для уменьшения погрешностей эксперимента. При этом точность определения содержания дейтерия в плазме крови составила ±1 ppm.
Для определения изотопного состава лиофи-лизированных органов лабораторных животных использован масс-спектрометр DELTAplus (Finni-gan, Германия). Твердые образцы заворачивали в металлическую фольгу и помещали в камеру сгорания с помощью автоматического пробоотборника Carlo Erba AS 200-LS. Изменение изотопного состава выражали в промилле (%е; часть на тысячу) с использованием стандартного дельта-обозначения 8:
5 = (Япробы/Ястанд - 1) X 1000 (%), (1)
где R — соотношение изотопов, ^пробы и ^станд — соотношение D/H в исследуемой пробе и стандарте. Калибровку измерений в твердых образцах выполняли относительно международного образца (IAEA-CH-7, 8D = —100.3%) и различных внутренних проверенных стандартов. Точность измерений составляла ~±2%е для твердого вещества.
Для эксперимента использовали три группы крыс по 20 штук в каждой группе. Первая группа — контрольная, в которой крысы употребляли дистиллированную минерализованную воду. Во второй группе крысы употребляли дистиллированную минерализованную воду с содержанием дейтерия 40 ppm. В третьей группе крысы употребляли дистиллированную минерализованную воду с содержанием дейтерия 100 ppm. В течение трех недель раз в неделю забивали двух крыс из каждой группы с целью определения содержания дейтерия в плазме крови. Через три недели с начала эксперимента вызывали окислительный стресс моделированием гнойной раны у крыс, при этом, использовали двухэтапную модель окислительного стресса [11]. Через четыре недели с начала эксперимента оставшихся крыс забивали, органы лиофилизировали в лиофильной сушилке Л С-1000 и определяли содержание парамагнитных центров на ЭПР-спектрометре, а содержание дейтерия — на масс-спектрометре.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Спектры ЭПР лиофилизированных образцов сердца лабораторных животных приведены на рис. 2 и содержат анизотропный синглетный сигнал, параметры спин-гамильтониана (g± = 2.0074, g|| = 2.003) которого соответствуют стабильным радикалам [12—14]. Спектры ЭПР образцов печени и почек имеют аналогичный характер.
У крыс, потреблявших воду с остаточным содержанием дейтерия 40 ppm, выраженный анти-
ОЦЕНКА АНТИРАДИКАЛЬНОИ АКТИВНОСТИ ВОДЫ
1509
323.5
0
Н, мТл
Рис. 2. Спектры ЭПР лиофилизированных тканей сердца лабораторных мышей контрольной (1) и опытной группы (2), употреблявшей ВМИС ССД 40 ррт, после четырех недель.
Содержание дейтерия, ррт 160
120 80
40
0
Контроль 2 неделя 4 неделя
1 неделя 3 неделя
И 40 ррт Ш 100 ррт
Рис. 3. Динамика изменения содержания дейтерия в плазме крови лабораторных животных.
1
оксидантный эффект наблюдали уже в течение первой недели, в лиофилизированных органах (печени, почках, сердце) наблюдали снижение количества парамагнитных центров (по данным ЭПР) в исследуемых тканях примерно на 32—38% по сравнению с контрольной группой. Это свидетельствует об уменьшении количества свободных радикалов и подтверждает благоприятное воздействие легкой воды на организм животных. В то же время у крыс, потреблявших воду с остаточным содержанием дейтерия 100 ррт, наблюдали менее выраженный антиоксидантный эффект: в лиофи-лизированных органах (печени, почках, сердце) наблюдали снижение количества парамагнитных центров (по данным ЭПР) в исследуемых тканях примерно на 24—27% по сравнению с контрольной группой.
Динамика изменения содержания дейтерия в плазме крови лабораторных животных при потреблении воды с остаточным содержанием дейтерия 40 и 100 ррт в ходе эксперимента представлена на рис. 3.
Как видно из рисунка, содержание дейтерия в плазме крови лабораторных животных по данным ЯМР-спектроскопии постепенно снижается и выходит на плато после трех недель употребления ВМИС ССД.
Содержание дейтерия в лиофилизированных тканях печени, почек и сердец лабораторных животных, употреблявших ВМИС ССД в течение месяца, представлены на рис. 4.
Из рис. 3 и 4 видно, что при употреблении воды с более низкой концентрацией дейтерия его концентрация снижается до более низкого уровня в плазме и тканях. Однако и в случае употребления воды с концентрацией 100 и 40ррт наблюдали выход на плато концентрации дейтерия в плазме и органах через три недели после начала употребления ВМИС ССД.
Содержание дейтерия, ррт
1401-
Контроль 100 ррт 40 ррт (1
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.