ПОЧВОВЕДЕНИЕ, 2015, № 3, с. 330-336
БИОЛОГИЯ ПОЧВ
УДК 631.461
ОЦЕНКА ЧИСЛЕННОСТИ, БИОМАССЫ И РАЗМЕРОВ КЛЕТОК БАКТЕРИЙ МЕТОДОМ "КАСКАДНОЙ" ФИЛЬТРАЦИИ В РАЗЛИЧНЫХ ПОЧВАХ
© 2015 г. Л. М. Полянская, И. П. Пинчук, Д. Г. Звягинцев
Факультет почвоведения МГУ им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы
e-mail: lpolyanskaya@mail.ru Поступила в редакцию 04.06.2014 г.
Исследовали дерново-подзолистую, серую лесную, бурую лесную, примитивную антарктическую почвы, чернозем типичный и солончак. Установлено, что во всех почвах наряду с мелкими клетками бактерий находится и много ультрамелких форм. Особенно в этом отношении выделяются серая лесная почва, бурая лесная почва и примитивная антарктическая почва. Ранее в работах по почвенной микробиологии факт измельчания клеток учитывался недостаточно полно из-за отсутствия надежных методов. Показано уменьшение численности и биомассы бактерий вниз по профилю во всех почвах, кроме солончака. В солончаке происходит увеличение численности и биомассы по мере уменьшения засоленности горизонтов. Биомасса бактерий, главным образом, зависит от доминирования клеток с определенными размерами (0.38 и 0.23 мкм). В примитивной антарктической почве в гор. B1 fungi зафиксировано значительное увеличение количества крупных клеток бактерий с диаметром 1.85 мкм, вследствие чего в этом горизонте максимально значение показателя биомассы. Данные по среднему объему одной клетки коррелируют с данными по численности и биомассе. Наибольшие диаметры зафиксированы в гумусовых горизонтах и в гор. B1 fungi примитивной антарктической почвы.
Ключевые слова: клетки бактерий, численность, размеры, биомасса, объем. DOI: 10.7868/S0032180X15030090
ВВЕДЕНИЕ
Хорошо известно о существовании большого количества разнообразных бактерий, называемых ультрамикробактериями, нанобактериями, карликовыми клетками, которые находятся в воздухе, обнаружены в минералах, в почвах, в атмосфере, в грозовых тучах и т.д. [9, 13—15, 20, 22, 23, 27]. Особое внимание обращено на мельчайшие формы жизни на нашей планете — бактерии, имеющие размеры, измеряемые нанометрами, диаметром 0.05—0.2 мкм [18]. С помощью эпилю-минесцентного микроскопа было обнаружено, что 0.2 мкм — наименьший диаметр бактериальной клетки [23]. Образование нанобактерий как ответной реакции клетки на неблагоприятные условия среды и стресс-факторы изучено на поведении тривиальных форм бактерий в лабораторных опытах [10, 11]. Культивирование, полученных наноформ на богатых питательных средах, приводит к возврату их к исходным формам [1, 26]. Большая часть полученных данных касаются констатации наличия клеток ультрабактерий или нанобактерий в почве и других местообитаниях [4, 3, 17, 24], но данных о численности разных по размеру бактерий в почвах нет.
Целью работы являлось определение методом "каскадной фильтрации" общей численности бактерий, биомассы и размеров клеток в почвах разных типов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследования послужили образцы горизонтов следующих почв:
1. Дерново-сильноподзолистой почвы Московской обл. Почва освоенная, несмытая супес-чано-легкосуглинистая на тяжелосуглинистом покровном суглинке, подстилаемом песчано-су-глинистой мореной. Растительность — осиново-кленовый лес. Горизонты: А, 0—10 см — лесная подстилка; АЕ2, 10—40 см — переходный; Е, 40— 50 см — элювиальный; БЫ, 50—60 см — переходный ; ВИ, 60—90 см — иллювиально-глинистый подгоризонт; В2^ 90—110 — иллювиально-гли-нистый.
2. Серой лесной почвы Тульской обл. Рельеф холмисто-равнинный-овражно-балочный. Признаков засоленности и заболоченности не выявлено. Почвообразующая порода — лёссовидные суглинки. Горизонты: А, 0—20 см — гумусовый;
АВ, 20—40 см — элювиально-иллювиальный; B1, 40—50 см — иллювиальный; В2, 50—80 см — иллювиальный; ВС, 80—90 см — переходный к породе.
3. Чернозема типичного. Образцы взяты в лесополосе Курской обл. Растительность — дуб череш-чатый (Quercus robur), ясень обыкновенный (Fráxi-nus excélsior), клен платановидный (Acer pla-tanoides). Горизонты: Ад, 0—12 см — дернина; А, 12—35 см — гумусово-аккумулятивный; АВ, 35— 65 см — гумусовый; В1, 65—110 см — карбонатный.
4. Солончака. Разрез заложен в Астраханской обл. Растительность — отдельные кустики полыни. В профиле отмечены выделения мелкокристаллических легкорастворимых солей, степень засоления уменьшается с глубиной. Горизонты: Ас, 0—20 см — поверхностный солевой; Вс, 20— 50 см — солевой; В2, 50—80 см — переходный; С, 80—100 см — материнская порода.
5. Бурой лесной кислой ненасыщенной сред-несуглинистой на элювиально-делювиальных отложениях (Камчатка). Растительность — береза Эрмана (Betula ermanii), тополь душистый (Populus suaveolens), рябина бузинолистная (Sor-bus sambucifolia). Горизонты: О, 0—6 см — рыхлая лесная подстилка; А, 6—13 см — гумусовый; АВ, 13—23 см — гумусово-оподзоленный; В1, 23—41 см — иллювиально-метаморфический; В2, 41—64 см — иллювиально-метаморфический; ВС, 64—94 см — переходный; С, 94—125 см — материнская порода.
6. Примитивной антарктической почвы влажных долин (Восточная Антарктида, Земля Принцессы Елизаветы). Влажная долина в зоне влияния талых вод снежника, днище выполнено элю-во-делювием гранитоида, полигональный рельеф с признаками морозного пучения. Почва переувлажнена за счет стояния талых вод над мерзлотным водоупором. В гор. B algae присутствуют многочисленные скопления одноклеточных водорослей, предположительно сине-зеленых и зеленых. В гор. B1 fungi зерна минералов обильно покрыты мицелием грибов и возможно актино-мицетов, мицелий настолько плотно покрывает минеральные отдельности, что придает горизонту белесый оттенок. С 45 см стоит надмерзлотная вода, разрез быстро затапливается. Горизонты: B algae, 0—2 см — моховая подстилка; B1 fungi, 2—
10 см, минеральный материал, ржаво-бурый крупнозернистый песок, покрытый белесым мицелием; B2, 10—14 см — минеральный материал, ржаво-бурый крупнозернистый песок, есть признаки мицелия (грибов или актиномицетов); В3, 14—40 см — песчаная подушка под каменной мостовой без признаков макробиоты; В3, 40— 60 см — минеральный материал, крупнозернистый песок без признаков макробиоты.
При определении численности и размеров бактерий использовался метод "каскадной" фильтрации, фильтровали почвенную суспензию через фильтры с диаметром пор 1.85, 0.43, 0.38 и 0.23 мкм и мембранные "Сынпор" с диаметром пор 0.17 мкм с помощью колбы Бунзена и водоструйного насоса. Собственную люминесценцию фильтров гасили окрашиванием насыщенным спиртовым раствором Судана черного (Feinchemie K. — H. Kallies KG, Germany), помещая их в этот раствор на несколько суток, затем промывали в стерильной воде, подсушивали и использовали для дальнейшей фильтрации [21].
На поверхность сеточки металлического фильтра колбы Бунзена помещали четыре слоя фильтровальной бумаги, сверху фильтр (ядерный или мембранный), который прижимали к поверхности прибора с помощью металлического кольца и добавляли фильтруемую суспензию. Фильтрование суспензии проводили последовательно от фильтра с большим размером пор к меньшему, фильтр с размером пор 1.85 мкм использовали исключительно для удаления крупных частиц почвы из суспензии.
Пропускали окрашенную акридином оранжевым (1 : 10000, в течение 2—3 мин) суспензию, учитывали клетки бактерий в 30 полях зрения, условно принимая размеры клеток равными диаметру пор фильтра, на котором они осаждались. В расчетах принимали, что клетки имеют шаровидную форму [10].
Расчет числа клеток на 1 г почвы проводили по формуле:
N =
S1an Vs2c,
где N — число клеток; — площадь фильтра, мкм2; a — количество клеток в одном поле зрения (усреднение производят по всем полям); п — показатель разведения почвенной суспензии (мл); V — объем профильтрованной суспензии, мл; S2 — площадь поля зрения микроскопа (мкм2); c — навеска почвы (г). Зная площадь фильтра и площадь поля зрения микроскопа, в итоге формула для расчета численности приобретала следующий вид:
ШЬ = a х 1.13 х 107.
При расчетах веса бактерий по обычной методике сухой вес бактериальной клетки объемом 0.1 мкм3 принимают равным 2 х 10-14 г [6]. В настоящей работе сухую биомассу рассчитывали, учитывая размеры клеток бактерий. Исходя из размеров пор каждого фильтра, находили биомассу одной клетки бактерии на каждом фильтре,
Дерново-подзолистая
Солончак
А, 0 АБ2, 10 Б, 40 БВг, 50 ВЦ, 60 В2г,90-
а
ин А, 0% АВ, 202 В1, 40-нт, В2, 502 ВС, 80-
и р
о
1-1
Серая лесная почва
Чернозем типичный
О, 0 А, 12 АВ, 35 В1, 65-
Ас, 0-20 Вс, 20-50 В2, 50-80 С, 80-100
0 40 80 120 0 20 60 100 140
20 40
0 1 40 1 80 1 120 0 20 60 100
20 40 60 80
Бурая лесная почва
О, 0-6 А, 6-13 АВ, 13-23 В1, 23-41 В2, 41-54 ВС, 64-94 С, 94-125
0 1 40 1 80 1 120 0 20 60 100
20 40 60 80
Примитивная антарктическая почва
с>0.43 а>0.38 I::>0.23 □ >0.17
60 80 107 кл/г
АВ, 0-2 В1 Гивд, 2-10 В2, 12-14 В3, 14-40 В3, 40-60
0 20 40 60 80100 0 20
40 60 80
107 кл/г
Рис. 1. Численность клеток бактерий, определенная методом "каскадной" фильтрации, и их распределение по размерам в изученных почвах.
а с учетом их численности находили биомассу всех клеток по формуле:
Въ _ 3пг х 2 х 10-14/0.1 N,
где Ь - размер каждой фракции, г - радиус, N — численность, В - биомасса.
Средний объем одной клетки рассчитывали по формуле:
В
V _ общ
^общ а
где Вобщ и - биомасса и численность всех фракций, а - плотность одной клетки, а = 1 х х 10-12 г/см3 , V - средний объем одной клетки. Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ STATGRAPHICS и STATISTICA. Среднее квадратическое отклонение (8И _ для значений численности бактерий в образце не превышало 5-10%.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
В дерново-подзолистой почве наибольшее количество бактерий наблюдается в гор. АЕ2 и В21 (57-76 х 107 кл. бактерий/г, рис. 1). С глубиной их численность уменьшается, и в иллювиальном го-
ризонте она становится равной 50 х 107 кл. бактерий/г почвы. Доминируют бактерии с диаметром 0.23 мкм, их максимум наблюдается в переходном гор. В2^ а численность бактерий на фильтре с диаметром пор 0.38 мкм максимальна в элювиальном горизонт
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.