БИОФИЗИКА, 2013, том 58, вып. 4, с. 582-586
МОЛЕКУЛЯР НАЯ БИОФИЗИКА =
УДК 57.044
ОЦЕНКА ПРООКСИДАНТНЫХ СВОЙСТВ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ
© 2013 г. И.П. Иванова, С.В. Трофимова, И.М. Пискарев*
Нижегоpодcкая гоcудаpcтвенная медицин^ая академия федеpального агент^ва по здpавооxpанению и тциальному pазвитию, 603005, Н. Новгоpод, пл. Минина и Пожаpcкого, 10/1;
*Научно-иccледовательcкий ижтитут ядеpной физики им. Д.В. CkобельцынаМо^ов^ого гоcудаpcтвенного унивеpcитета им. М.В. Ломонотва, 119991, Мо^ва, Ленижкие гоpы, 1, ^p. 2 Поступила в p едакцию 28.11.11 г. После последней доработки 22.01.13 г.
Исследована хемилюминесценция раствора аскорбиновой кислоты в реакции Фентона при концентрациях кислоты от 10-7 до 1 моль/л. В присутствии растворенного кислорода при концентрации аскорбиновой кислоты ~ 10-4-10-3 моль/л выход хемилюминесценции превышает спонтанное свечение раствора Фентона, проявляются прооксидантные свойства. В отсутствие кислорода этот эффект не наблюдался. Сравнение расчета процесса окисления с экспериментом показывает, что аскорбиновая кислота является антиоксидантом. П рооксидантными свойствами обладают продукты ее превращений в присутствии кислорода.
Ключевые cnова: pаcтвоp Фентона, xемилюмине^енция, аcкоpбиновая кжлота, антиожидант, npоокcидант.
Аскорбиновая кислота является одним из самых распространенных антиоксидантов. Однако известно также, что при определенных концентрациях аскорбиновая кислота может проявлять оксидантные свойства. Вопрос о свойствах аскорбиновой кислоты широко обсуждается в литературе [1]. Одним из возможных вариантов тестирования свойств антиоксидантов является наблюдение хемилюминесценции, возникающей под действием активных частиц, в реакции Фентона [2]. Если обозначить через S 0 светосумму хемилюминесценции в растворе Фентона, а S - светосумму за то же время, но с введенным исследуемым веществом, то пр и S /S 0 < 1 можно говорить об антиокси-дантном эффекте, а пр и S/S 0 >1 о проокси-дантном.
Сравнение расчета химической кинетики окисления с экспериментом позволяет делать выводы об антиоксидантных и прооксидантных свойствах исследуемых веществ и продуктов их окисления.
В работе [3] проанализирован механизм свечения раствор а Фентона при добавлении в него веществ различной природы и предложена численная модель процесса, позволяющая рассчитывать свечение такого раствора при условии, что известна схема реакций окисления данного
Сокращение: DHA - dehydroascorbic atid.
вещества активными частицами в растворе Фентона. В данной р аботе выполнен р асчет кинетики хемилюминесценции для аскорбиновой кислоты, а также экспериментально изучено и рассчитано отношение светосумм S /S 0 при разных концентрациях кислоты.
МЕТОДИКА ЭК СПЕРИМЕНТА
И сследовали хемилюминесценцию аскор биновой кислоты в реакции Фентона. Световое излучение регистрировали люминометром БХЛ-06 (Нижний Новгород, Россия). Спектральный диапазон чувствительности ФЭУ 400700 нм. Калибр овки пр ибора осуществляли по эталонному источнику света известной интенсивности.
При регистрации излучения от образца оценивали уровень шума регистрирующего прибора, который вычитался автоматически. Измерение шума проводили непосредственно перед и сразу после каждого измерения. Нижний предел обнаруживаемости излучения для данного прибора определяется флуктуациями шума. Измерения показали, что среднеквадратичные флуктуации шума составляют от 200 до 500 импульсов в секунду, поэтому минимально обнаруживаемый эффект составляет около 200 фотонов в секунду. И сследовали обр азцы объемом 1,0 мл. П роба состояла из 0,4 мл раствора Ре804, 0,4 мл исследуемого вещества, 0,2 мл
Таблица 1. Реакции окисления аскорбиновой кислоты AscH 2. AscH и Asc2 - продукты первой и второй ступени диссоциации аскорбиновой кислоты. Asc*- - а скорбат ион-р адикал, DHA - dehydro ascorbic acid
№ Реакция Константа равновесия, константа скорости [7-9]
1. AscH2 0 AscH- + H+ i I к и р
2. AscH- 0 Asc2- + H+ р*а2 = 11,8
3. AscH- + OH* ^ Asc*- + H2O k3 = 1,11010 (моль-с)-1
4. 2Asc*- + H+ ^ AscH- + DHA k4 = 1,4-105 (моль-с)-1
5. Asc2- + O2 ^ Asc*- + O2- k5 = 100 (моль-с)-1
раствора перекиси водорода. Концентрации реагентов: [Бе804] = 10-3 моль/л, [Н202] = 10-4 моль/л, [А8с] - от 5,7-10-1 до 5,7-10-5 моль/л.
Кювету с пробой располагали почти вплотную к фотокатоду ФЭУ, что обеспечивало высокую эффективность регистрации (телесный угол П = п). В кювету сначала вводили раствор двухвалентного железа, затем исследуемое вещество и в последнюю очер едь - перекись водорода. Раствор перекиси водорода для реак-тива Фентона требуемой концентрации готовили предварительно, раствор РеБ04 - непосредственно перед началом эксперимента. Регистрацию излучения начинали через 0,5-1 с после введения раствора перекиси. Это время необходимо для того, чтобы перевести прибор в режим измерения интенсивности хемилюми-несценции после добавления перекиси в измерительную кювету. И спользовали реактивы квалификации «чда», бидистиллированную свежеприготовленную воду (рН 6). Измерения про -водили в растворах, насыщенных кислородом воздуха, а также обедненных кислородом после введения в пробу 0,1 мл Ка280з с концентра -цией 3,2 г/л.
Хемилюминесценцию растворов регистрировали в течение 30 с. Каждую точку обсчитывали в 10-12 повторах. Состав растворов и продуктов реакции на разных стадиях контро -лировали по УФ -спектрам с помощью прибора «Флюорат-02 Панорама» («Люмекс», Россия).
Спектральные характер истики излучения образцов качественно оценивали с помощью светофильтров из синих и красных пластиковых пленок толщиной 0,5 мм. Спектр пр опускания пленок измеряли прибором «Флюорат-02 Панорама». Полоса пропускания синего фильтра на уровне не менее 10% от максимума лежит в диапазоне от 410 до 590 нм, красного - от 590 до 750 нм. Отбирали пленки, не дающие вторичного излучения в видимой области спектра. Расчет реакций химической кинетики окисления аскорбиновой кислоты был выполнен с помощью пакета МаШСаё 14.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Наличие у аскорбиновой кислоты как ан-тиоксидантных, так и прооксидантных свойств неоднократно отмечалось исследователями [1,7,8]. Схема реакций в растворе Фентона рассмотрена в работах [4,5], механизм свечения -в работах [3,6]. С вечение возникает в результате образования ион-радикала O2- после цепочки его превращений:
O2- + OH • + Н+ ^ H2O + O2(a1Ag);
O2(a1Ag) + O2(a1Ag) ^ 2O2 + у.
П ри расчете свечения раствора учитывались все реакции между активными частицами, приведенные в работах [3-6]. Схема окисления аскорбиновой кислоты представлена в табл. 1. Использованы характеристики реакций из работ [7-9]. Аскорбиновая кислота в водном растворе диссоциирует в две стадии (реакции 1 и 2, табл. 1). При значениях рН, характерных для биологических объектов (рН от 6,0 до 7,5) аскорбиновая кислота (р^1 = 4,1) находится в растворе в виде ионов Л8сН" (больше 99%), поэтому рассматривалось окисление именно этих ионов.
Первичным продуктом окисления Л8сН" является радикал Л8с*- (реакция 3, табл. 1). Осо -бенностью а скорбиновой кислоты является то, что ни сам ион Л8сН", ни радикал Л8с*- с кислородом не взаимодействуют [8]. С кислородом взаимодействует только ион Л8с2- (реакция 5), образуя ион-радикал O2-. Расчет показал, что вклад этой реакции мал из-за малой концентрации Л8с2-. Два радикала Л8с*- превращаются в исходный ион и БНЛ (dehydro-а8согЫс add), реакция 4. Далее БНЛ окисляется под действием кислорода с образованием различных соединений, в числе которых есть про -оксиданты, например щавелевая кислота.
Рассчитанная зависимость S/Sо от концентрации аскорбиновой кислоты, не учитывающая продуктов превращения БНЛ, представле-
584
ИВАНОВА и др.
Таблица 2. Уровень хемилюминесценции водных растворов аскорбиновой кислоты при окислении реактивом Фентона ре2+] = 10-3 моль/л, [Н2О2] = 10-4 моль/л в присутствии и отсутствие кислорода (экспериментальные и р асчетные данные)
Концентрация As^ моль/л Эксперимент, S/S 0 Расчет, S /S 0
Присутствует O2 Обеднен O2 П рисутствует O2 Нет O2
110-7 - - 1 1
5,7-10-5 1,0 ± 0,1 0,17 ± 0,02* 0,81 0,81
5,7-Ш-4 2,73 ± 0,25 0,33 ± 0,03* 0,28 0,28
5,7-10-3 1,33 ± 0,12 0,47 ± 0,05* 0,04 0,04
5,7-10-2 0,6 ± 0,05 0,16 ± 0,015* 0,024 0,11
5,7-10-1 0,51 ± 0,05 0,15 ± 0,015* 0,31 0,04
1 - - 0,044 0,007
Примечание. * - Значения S/S0, в растворе, обедненном О2, статистически значимы относительно значений S/S0 в растворе в присутствии О2 (по каждой концентрации As^, p < 0,05.
на в табл. 2 для двух случаев: в р а створа х с кислородом и без. Видно, что в отсутствие кислорода S/S0 монотонно уменьшается с ростом концентрации аскорбиновой кислоты, а в присутствии кислорода при [As^ > 10-3 моль/л отношение S /S 0 возрастает. Возрастание связано с образованием в реакции 5 супероксидного ион-радикала O2-. В ходе реакций, происходящих в растворе Фентона, этот радикал может, хотя и с малой вероятностью, превращаться в гидроксильный радикал OH*. В этом случае аскорбиновая кислота будет поглощать инициированные ее окислением вторичные радикалы. Таким образом, из расчета следует, что при концентрации аскорбиновой кислоты до 1 моль/л антиоксидантный эффект будет иметь место, хотя вероятность подавления радикалов с ростом концентрации кислоты в присутствии кислорода будет уменьшаться.
Полученная экспериментально зависимость S/S0 в широком диапазоне концентраций аскорбиновой кислоты представлена также в табл. 2. Измерения выполнены для двух случаев: 1 - в растворе присутствует растворенный в естественных условиях кислород; 2 - раствор обеднен кислородом путем добавления в пробу 0,1 мл Na2SO3 с концентрацией 3,2 г/л. В работе установлено, что введение Na2SO3 не влияет на свечение раствора Фентона.
Показано, что в присутствии кислорода при малых концентрациях аскорбиновой кислоты величина S /S 0 = 1, что может быть связано в первую очередь с малым вкладом вторичных реакций в общий поток радикалов, начало которым дает взаимодействие As^- + OH*, ра -дикалы OH* генерируются в реакции Фентона. С увеличением концентрации аскорбиновой кислоты до 10-4 моль/л отношение S /S 0
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.