ФИЗИОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ, 2004, том 51, № 4, с. 626-630
= МЕТОДИКА =
УДК 581.1
ОЦЕНКА РЕТАРДАНТНОЙ АКТИВНОСТИ ТРИАЗОЛОВ В a-АМИЛАЗНОМ БИОТЕСТЕ НА ЭНДОСПЕРМЕ ЯРОВОГО ЯЧМЕНЯ
© 2004 г. Л. Д. Прусакова, С. И. Чижова, В. В. Павлова*
Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева Российской академии наук, Москва * Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгелъгарда Российской академии наук, Москва
Поступила в редакцию 05.08.2003 г.
Изучена возможность использования экспресс-метода биотестирования по активности гидролитического фермента a-амилазы алейронового слоя эндосперма семян ячменя (Hordeum vulgare L.), расщепляющей крахмал до растворимых сахаров, для оценки ретардантного действия триазолие-вых соединений (паклобутразола, униконазола и азовита). Действие триазолов оценивалось по подавлению активности a-амилазы, индуцированной экзогенной ГК3. По ретардантной активности испытанные препараты располагались в следующем порядке: униконазол > азовит ~ паклобутразол ~ ~ хлорхолинхлорид. Наибольшей чувствительностью к действию ретардантов отличался сорт Носовский 9. Испытанные триазолиевые соединения в концентрациях 10-7-10-3 М проявляли ретар-дантную активность в биотестах с проростками длинностебельного гороха сорта Торсдаг ярового ячменя сортов Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85. Показана возможность использования перечисленных экспресс-биотестов для оценки ретардантной активности триазолов.
Hordeum vulgare - паклобутразол - униконазол - азовит - хлорхолинхлорид - активностъ а-ами-лазы - экзогенная ГК3 - рост - ретарданты
Ретарданты ингибируют рост осевых органов растений, стимулируют рост их корневой системы, повышают устойчивость к стрессовым факторам окружающей среды и продуктивность. Однако в связи с все возрастающими требованиями к экологической безопасности применения регуляторов роста возникает проблема замены широко используемых в растениеводстве среднетоксич-ных препаратов, например хлорхолинхлорида (ССС), на слаботоксичные. Представителями соединений нового поколения ретардантов являются триазолиевые соединения - паклобутразол, униконазол, азовит, характеризующиеся высокой эффективностью в малых концентрациях и низкой токсичностью, не загрязняющие окружающую среду [1, 2]. Триазолы, в отличие от ССС, подавляют биосинтез ГК на трех последовательных стадиях превращения энт-каурена в энт-кау-реновую кислоту, что обуславливает их высокую ретардантную активность [3, 4]. Приведенная характеристика позволяет считать их перспективными соединениями для предупреждения полега-
Сокращение: ССС - хлорхолинхлорид.
Адрес для корреспонденции: Прусакова Лидия Дмитриевна. 127276 Москва, Ботаническая ул., 35. Институт физиологии растений РАН. Факс: 07(095) 977-80-18; электронная почта: ifr@ippras.ru
ния ярового ячменя и риса, для которых ССС не эффективен [3, 5, 6].
Цель данной работы состояла в том, чтобы выяснить, можно ли использовать для экспресс-оценки ретардантной активности соединений триазо-лиевого ряда а-амилазный биотест с эндоспермом семян ярового ячменя, а также биотесты с проростками длинностебельного гороха и ячменя.
МЕТОДИКА
Для оценки ретардантной активности соединений триазолиевого ряда использовали набухшие семена ярового ячменя (Hordeum vulgare L.) сортов Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85 [7]. Испытали три производных триазола: униконазол, [1-(4-хлорфенил)-4,4-диметил-2-(1,2,4-триа-зол-1-ил)-1-пентен-3-ол] ("Sumitomo Chemical COLTD", Япония); азовит, [1-(4-хлорфенокси)-3,3-диметил-1-(1Н-1,2,4-триазол-1-ил)-2-бутанон], синтезированный в Институте химических средств защиты растений (Россия); паклобутразол, [(2RS, 3RS)-1-(4-xлорфенил)-4.4-диметил-2-(1.2,4-три-азол-1-ил)-пунтан-3-ол] ("Imperial Chem. Ind. PLC", Великобритания). В качестве эталона брали ССС.
а-Амилазный биотест. Из семян ячменя, после их замачивания в воде в течение 3 ч, удаляли зародыш, зерновки делили пополам по бороздке, эндосперм помещали срезанной частью на агаро-
Г*.1
L'd
ГК3, 10-5 м
ГК3, 10-5 м + PP333, 10-5 м
Рис. 1. Оценка ретардантной активности паклобутразола (РР333) биотестированием по активности а-амилазы, индуцированной экзогенной ГК3, в эндосперме семян ячменя, лишенных зародыша.
во-крахмальные блоки и инкубировали в термостате при 26°С в течение 24 ч. В опытах использовали 1%-ные агарово-крахмальные блоки, содержащие экзогенную Гк3 ("Sigma", США) в диапазоне концентраций от 10-7 до 10-3 М и триа-золы в тех же концентрациях. Контрольные ага-рово-крахмальные блоки не содержали ни ГК3, ни триазолы. Активность а-амилазы (по способности гидролизовать крахмал) определяли с помощью раствора Люголя, содержащего I2. По диаметру неокрашенного Люголем "кольца" вокруг эндосперма судили о ретардантном действии три-азолов на активность а-амилазы (рис. 1). Каждый вариант тестируемых ретардантов повторяли 30-кратно. Результаты статистической обработки данных показали высокую чувствительность и точность метода. Квадратическая ошибка репрезентативности для выборочной средней арифметической составила около 3%. Расчет критерия достоверности оценок (¿-критерия Стьюдента) показал, что разница между средними величинами опыта и контроля была в высшей степени достоверна (Р < 0.001).
Биотест с проростками гороха. Для сравнения ретардантная активность триазолов была оценена с помощью биотеста на 7-дневных проростках длинностебельного гороха сорта Торсдаг [8]. Опыты проводили в 15-кратной повторности.
Биотест с проростками ячменя. Перед проращиванием семена встряхивали на ротаторе с растворами паклобутразола, азовита или унико-назола Проростки выращивали до 7-дневного возраста в факторостатных условиях при 26°С и влажности воздуха 39.5%. Контролем служили семена, которые предварительно встряхивали с дистиллированной водой. Повторность опытов -15-кратная.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Биотест с а-амилазой
Для установления оптимальных доз ретар-дантного действия униконазола, паклобутразола и азовита использовали эндосперм семян ячменя, лишенный зародыша, определяя степень подавления активности а-амилазы, индуцированной экзогенной ГК3.
Выявлены различия в действии триазолов на активность а-амилазы в зависимости от их структуры и концентрации, а также сорта ячменя (рис. 2). Так, у ячменя сорта Носовский 9 активность а-амилазы, индуцированная экзогенной ГК3 в концентрации 10-5 М, подавлялась паклобутразолом и униконазолом (тоже в концентрациях 10-5 М) на 18 и 53% соответственно (рис. 2а). У ячменя сорта Зазерский 85 паклобутразол, азовит и уникона-зол в тех же концентрациях подавляли активность фермента на 10, 20 и 42% соответственно (рис. 26). В то же время у ячменя сорта Московский 2 паклобутразол не оказывал ингибирующе-го действия на активность а-амилазы в отличие от азовита и униконазола (рис. 2в). При этом среди изученных соединений наибольшим ингибиру-ющим действием в концентрации 10-5 М обладал униконазол, несколько меньшим - азовит и паклобутразол и наименьшим - ССС. Стабильное ин-гибирующее действие на активность а-амилазы проявлялось у униконазола в диапазоне концентраций 10-8-10-5 М, у азовита и паклобутразола - в концентрациях 10-7-10-3 М. Таким образом, триа-золиевые соединения ингибировали активность а-амилазы в эндосперме ячменя всех трех сортов: Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85. В то же время у ячменя выявлены сортовые различия в чувствительности к действию соединений триа-золиевого ряда (рис. 2).
Сравнительное изучение действия триазолие-вых соединений и ССС на активность а-амилазы
5
1-0 Г Носовский 9 0.8
0.6
0.4
0.2
01-^
-7 -6 -5 -4 -3
1 2 lgC [M]
Зазерский 85 5
-7 -6 -5 -4 -3 lgC [M]
Московский 2
« 120
о р
H
w
о
к
H
о
cd
и
е
Ю
о
с
H
с о
рц
80
60
40
20
-4 -3 lgC [M]
5 -4 -3 lgC [M]
Рис. 2. Влияние униконазола (1), паклобутразола (2) и азовита (5) по сравнению с ССС (4) на активность а-амилазы, индуцированную экзогенной ГК3, в эндосперме семян ячменя трех сортов. 1-4 - триазолиевые соединения в сочетании с ГК3 (10-5 М), 5 - ГК3.
при оптимальной концентрации экзогенного ГК3 (10-5 М) показало, что ССС, прерывающий биосинтез ГК на стадии циклизации энт-каурена, ин-гибировал активность а-амилазы в меньшей сте-
Рис. 3. Влияние униконазола (7), паклобутразола (2), азовита (3) и ССС (4) на рост 7-дневных проростков длинностебельного гороха сорта Торсдаг.
пени, чем триазолы - азовит, паклобутразол и униконазол, оказывающие блокирующее действие на более поздней ступени биосинтеза ГК - в трех последовательных стадиях превращения энт-каурена в энт-кауреновую кислоту [3]. Более эффективное снижение активности гидролитического фермента триазолами по сравнению с ССС, ретардантом группы четвертичных аммониевых оснований, в проведенных экспериментах (рис. 2) соответствовало наиболее сильному понижению триазолами уровня биологически активных ГК, что согласуется с данными Муромцева с сотр. [9].
Биотесты с проростками
Аналогичные результаты, свидетельствующие о высокой физиологической активности триазолов, мы получили в биотесте с проростками длинностебельного гороха сорта Торсдаг. Оптимальный ретардантный эффект был выявлен у униконазола в концентрации 10-5 М (60%-ное ин-гибирование роста), в то же время азовит и паклобутразол ингибировали рост проростков в концентрациях 10-4 М на 67% и 52% соответственно (рис. 3).
У 7-дневных проростков ячменя сорта Носовский 9, Московский 2 и Зазерский 85 после предпосевной обработки семян триазолами отмечали стабильное торможение роста надземных органов и стимуляцию корневой системы, за исключением варианта с азовитом у проростков сорта Московский 2 (рис. 4). При этом была выявлена прямо пропорциональная зависимость между ин-гибированием триазолами роста проростков и гидролитической активностив a-амилазы, которое ослабевало в ряду паклобутразол > униконазол > > азовит.
Таким образом, изучение влияния различных форм триазолиевых соединений на активность a-амилазы эндосперма ячменя, лишенного заро-
30 25
л
I 20
о
к , ~
се
к н ч Н
§
0
Я 5 8 10
15
л
к н
Н 20
Московский 2
20
15
10
£
с
се и
о
VO
о
к
Л К
и
ч Н
£
с
Л 5
Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.